Pipetty電動移液器在克羅諾桿菌定性檢驗中的應用

方案摘要：本方案整合 Pipetty 電動移液器與 RAYPA 培養基自動制備分裝儀的技術優勢。流程涵蓋增菌培養、分離培養、 PCR 鑒定及生化確證試驗：RAYPA 儀器實現 BPW、LST-Vm 肉湯等培養基的標準化制備與精準分裝，保障培養基成分均勻、體積一致；Pipetty 電動移液器貫穿移液、接種、PCR 反應體系配制等關鍵環節，提升微升級操作精度。通過自動化儀器替代部分手動操作，減少人為誤差與污染風險，增強檢測結果的穩定性和可重復性，同時提升整體檢測效率。最終結合菌落特征、生化鑒定及可選 PCR 結果，精準報告 100g (mL) 樣品中克羅諾桿菌的檢出情況，為食品微生物安全檢測提供高效可靠的技術方案。
 
方案詳情：
一、實驗原理
       克羅諾桿菌定性檢驗核心是 “富集 - 篩選 - 驗證 - 確證” 的遞進邏輯。先以 BPW 培養基前增菌富集目標菌，再用 LST-Vm 肉湯選擇性增菌抑制雜菌、擴增目標菌。通過克羅諾桿菌顯色培養基的特異性顯色反應，篩選出可疑菌落。可選 PCR 鑒定利用特異性引物，靶向擴增目標菌 282bp 特征基因片段，實現分子層面快速驗證。最終通過生化鑒定，依據克羅諾桿菌獨特的代謝生化特征，排除假陽性，確證菌株身份，最終判定樣品中是否存在該菌。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下：
① Pipetty 電動移液器；
② 恒溫培養箱:36 ℃士1 ℃,41.5 ℃±1℃；
③ 冰箱:2 ℃~5 ℃,-20 ℃；
④ 恒溫水浴箱:41.5 ℃±1℃；
⑤ 天平:感量 0.1g、0.01g；
⑥ 振蕩器；
⑦ 無菌容器:容量 100mL、200mL、2000 mL；
⑧ 無菌培養皿:直徑90mm；
⑨ pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙；
⑩ 微生物生化鑒定系統；
⑪ PCR儀；
⑫ 離心機:轉速≥12000r/min；
⑬ 凝膠成像系統或紫外檢測儀；
⑭ 瓊脂糖水平電泳儀或毛細管電泳儀；
⑮ PCR反應管；
⑯ RAYPA培養基自動制備分裝儀；
 
2、試劑和材料
① 緩沖蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)；
② 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium,mLST-Vm)；
③ 克羅諾桿菌顯色培養基；
④ 胰蛋白胨大豆瓊脂(trypticase soy agar,TSA)；
⑤ 生化鑒定試劑盒；
⑥ 氧化酶試劑；
⑦ L-賴氨酸脫羧酶培養基；
⑧ L-鳥氨酸脫羧酶培養基；
⑨ L-精氨酸雙水解酶培養基；
⑩ 糖類發酵培養基；
⑪ 西蒙氏檸檬酸鹽培養基；
⑫ 內轉錄間隔區(its)PCR引物；
⑬ 5U/μL 耐熱 DNA 聚合酶。
⑭ 2.5mmol/dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP、25mmol/L MgCl₂；
⑮ 10×PCR 緩沖液、DNA 提取試劑、商品化 PCR 反應預混液；
⑯ 克羅諾桿菌質控菌株；
⑰ 大腸埃希氏菌質控菌株；
⑱ 核酸染色劑；
⑲ 分子質量標準:100 bp DNA ladder。
⑳ 50×TAE電泳緩沖液、6×DNA加樣緩沖液。
 
三、實驗步驟
1、用 RAYPA 培養基自動制備分裝儀，按配方精準制備 BPW 培養基并預熱至 41℃±1℃，通過儀器自動分裝 900mL至無菌容器中。取100g (mL)檢樣加入 BPW容器，搖勻，36℃±1℃培養18h±2h 完成前增菌。用 Pipetty 電動移液器精準移取1mL前增菌液，轉入由RAYPA提前制備并分裝的10ml LST-Vm肉湯管中。41.5℃±1℃培養 24h±2h，完成選擇性增菌。
 
2、分離培養
① 混勻 LST-Vm 肉湯培養物，用 Pipetty 電動移液器精準吸取 10μL 培養物。將吸取的培養物分別劃線接種于2個克羅諾桿菌顯色培養基平板。平板由 RAYPA提前自動制備，保證培養基厚度均勻、成分穩定，提升菌落生長一致性。36℃±1℃培養 24h±2h。
 
② 按顯色培養基判定標準挑取可疑菌落，每個平板至少挑 5 個（不足則全挑），用 Pipetty輔助接種，分別劃線接種 TSA 平板，36℃±1℃培養 24h±2h 備用。
3、PCR鑒定
① 從TSA平板挑 2-3 個可疑菌落至 500μL 滅菌去離子水中，混勻后 100℃加熱 10min，冰浴冷卻至室溫。12000r/min 離心 10min，取上清液作為 DNA 模板。
② 引物：見表1。
 
② 反應體系：使用 Pipetty 電動移液器連續分液模式，按表 2 比例精準移取各組分，加入到PCR反應管中，使用電機代替人工操作，可有效避免人為誤差，確保反應體系濃度均一，提升擴增重復性。
 
③ 反應條件：94℃預變性 5min；94℃變性 30s、61℃退火 30s、72℃延伸 30s（35 個循環）；72℃延伸 5min，4℃保存。
3、每次 PCR 鑒定時使用克羅諾桿菌標準菌株 DNA 模板作為陽性對照,大腸埃希氏菌標準菌株DNA 模板作為陰性對照,提取過程設置滅菌去離子水作為 DNA 提取空白對照,PCR 反應需另設滅菌去離子水作為 PCR 反應體系空白對照。
4、用1×TAE電泳緩沖液制備含核酸染色劑的1.5%瓊脂糖電泳凝膠。在電泳槽中加入電泳緩沖液,使液面沒過膠面。將適量PCR擴增產物與6×加樣緩沖液混合后點樣,其中第1孔加入 100 bp DNA ladder。電壓的設置根據公式--電泳槽正負極的距離(cm)X5 V/cm計算并設置,電泳時間為 20 min~30 min。使用凝膠成像系統或紫外檢測儀觀察和記錄結果。也可采用毛細管電泳儀等設備進行電泳。
5、PCR鑒定結果判定
質控系統:陰性對照和空白對照均未出現擴增條帶,陽性對照出現預期大小(282bp)的擴增條帶,則檢測系統正常。任一種對照出現非上述正常結果,應重做試驗,同時排除干擾因素。
陽性結果:在質控系統正常的情況下,待測樣品出現預期大小(282 bp)的擴增條帶,判定 PCR 結果為陽性。
陰性結果:在質控系統正常的情況下,待測樣品未出現預期大小(282 bp)的擴增條帶,判定 PCR 結果為陰性。
6、確證實驗
自 PCR 結果陽性的 TSA 平板上挑取菌落進行生化鑒定，PCR 結果陰性的 TSA 平板不再進行生化鑒定。
 
四、結果報告
根據菌落特征、PCR 鑒定結果,報告 100g(mL)樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌。