RAYPA在食品單核細胞增生李斯特氏菌定性檢驗中的應用

方案摘要：方案針對單核細胞增生李斯特氏菌檢測，整合 RAYPA 培養基自動制備分裝儀核心優勢，優化檢測全流程。儀器實現培養基溶解、滅菌、恒溫攪拌、精準分裝一體化操作，可自動完成 FB 增菌肉湯、OA 顯色培養基等多類培養基制備，控溫精準、分裝誤差小，保障培養基成分均一性。同時，減少手動操作帶來的污染風險與人為誤差，批量制備效率提升 40% 以上。流程以自動化培養基制備為基礎，銜接樣品增菌、分離培養、生化鑒定等環節，既符合 GB 4789.30-2025 標準要求，又適配規模化檢測需求，實現檢測高效性與結果可靠性的雙重保障。
 
方案詳情：
一、實驗原理
      通過增菌培養富集目標菌，利用選擇性培養基分離單菌落，結合形態特征、生化反應及溶血特性等進行綜合鑒定，最終確認是否存在單核細胞增生李斯特氏菌。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① RAYPA培養基自動制備分裝儀；
② 冰箱；
③ 恒溫培養箱:30 ℃±1 ℃、36 ℃±1℃、25 ℃~30 ℃
④ 均質器。
⑤ 顯微鏡:100 x~1 000 x。
⑥ 電子天平:感量為 0.1 g、0.1 mg。2.5
⑦ 錐形瓶:100 mL、500 mL。
⑧ 無菌培養皿:直徑 90 mm。
⑨ 無菌試管:16 mm x 160 mm。
⑩ 離心機:4 000 r/min。
⑪ 無菌離心管:30 mm x 100 mm。
⑫ 無菌涂布棒。
⑬ 單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC 19111 ；
⑭ 英諾克李斯特氏菌(Listeria innocua)ATCC 33090 ；
⑮ 伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)ATCC 19119；
⑯ 斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri)ATCC 35967；
⑰ 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923 ；
⑱ 馬紅球菌(Rhodococcus equi)ATCC 6939 ；
⑲ 小鼠:ICR 品系,體重 18 g~22 g。
⑳ 微生物生化鑒定系統及無菌過濾裝置。
 
2、試劑和材料
① 含 0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)；
② 含 0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)；
③ Fraser 增菌肉湯(FB,、FB,)；
④ OA李斯特氏菌顯色培養基；
⑤ PALCAM 培養基；
⑥ 革蘭氏染色液；
⑦ SIM 動力培養基；
⑧ 緩沖葡萄糖蛋白胨水；
⑨ 羊血瓊脂；
⑩ 無菌磷酸鹽緩沖液；
⑪ 無菌生理鹽水；
⑫ 糖發酵管；
⑬ 過氧化氫試劑；
⑭ 微生物生化鑒定試劑盒。
 
三、實驗步驟
1、使用RAYPA培養基自動制備分裝儀，提前制備試驗所需的各類培養基并分裝至無菌培養皿，靜置凝固備用。
 
2、以無菌操作取 25 g(mL)樣品,置于盛有 225 mL FB,增菌肉湯的無菌均質杯內,8000 r/min~10 000 r/min 均質1 min~2 min,或放入盛有 225 mL FB,增菌肉湯的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打 1 min~2 min,制成1:10 的樣品勻液。若樣品為液態,也可采用振蕩或攪拌混勻。于 30 ℃±1℃培養 24 h±2 h。使用Pipetty電動移液器，混勻,吸取 0.1 mL FB,增菌肉湯,轉種于 10 mL FB,增菌肉湯內。于 30 ℃±1℃培養24 h±2 h。
3、取混勻后的 FB,增菌肉湯,分別接種于用RAYPA培養基制備分裝儀提前分裝好的 OA李斯特氏菌顯色培養基平板和 PALCAM 培養基平板,36 ℃±1℃ 培養 24 h~48h,觀察各個平板上生長的菌落。典型菌落在 OA李斯特氏菌顯色培養基平板上形成直徑為1mm~3 mm 的圓形藍綠色菌落,周圍有不透明的暈圈。典型菌落在 PALCAM 培養基平板上形成直徑為1mm~3 mm 的圓形灰綠色菌落,周圍有棕黑色水解圈,培養 48h后,部分菌落中心形成黑點且有凹陷。其他等效李斯特氏菌顯色培養基平板上的菌落特征參照產品說明進行判定。
注 1:一些單核細胞增生李斯特氏菌在 OA李斯特氏菌顯色培養基上的菌落周圍的暈圈不明顯甚至沒有暈圈。還有一些單核細胞增生李斯特氏菌在 OA李斯特氏菌顯色培養基上的菌落周圍的暈圈出現得比較遲緩,有時需要 4d 以上才出現。
注 2:伊氏李斯特氏菌在 OA李斯特氏菌顯色培養基上的菌落形態與單核細胞增生李斯特氏菌相似,
4、從每個平板中挑取3個~5 個典型或可疑菌落(少于3個全選),在 TSA-YE平板或羊血平板上劃線,于36℃±1 ℃培養18h~24 h。單核細胞增生李斯特氏菌在 TSA-YE平板或羊血平板上,呈灰白色,半透明,邊緣整齊,露滴狀菌落、直徑為1 mm~2 mm。
 
5、篩選與鑒定
① 挑取 TSA-YE平板或羊血平板上的單個菌落,接種木糖、鼠李糖發酵管,于36℃±1℃培養 24 h±2 h，同時在 TSA-YE平板或羊血平板上劃線,于 36 ℃±1 ℃培養18 h~24 h,以獲取下一步鑒定用的純培養物。然后選擇木糖陰性,鼠李糖陽性的純培養物繼續進行鑒定。
② 鏡檢:挑取 18 h~24 h純培養的單個菌落做革蘭氏染色鏡檢,李斯特氏菌為革蘭氏陽性短桿菌,大小為(0.4 μm~0.5 μm)X(0.5 μm~2.0 μm)。用生理鹽水制成菌懸液,在油鏡或相差顯微鏡下觀察該菌出現輕微旋轉或翻滾樣的運動。
③ 動力試驗:挑取 18 h~24h純培養的單菌落穿刺半固體或 SIM 動力培養基,于25 ℃~30 ℃培養 48 h±2 h。李斯特氏菌沿穿刺線以不規則的云霧狀向四周延伸生長,培養基表面下3mm~5 mm處形成一似傘狀(或梭狀)界面。如傘狀(或梭狀)生長不明顯,可繼續培養,每天觀察結果1次,觀察5 d。
④ 生化鑒定:挑取 18 h~24h純培養的單個菌落,進行過氧化氫酶試驗,過氧化氫酶陽性反應的菌落繼續進行糖發酵試驗、MR-VP試驗。單核細胞增生李斯特氏菌的主要生化特征見表 1。
⑤ 溶血試驗:將新鮮的羊血瓊脂平板底面劃分為 20個~25 個小格,挑取 18 h~24h純培養的單個菌落刺種到血平板上,每格刺種1個菌落,并刺種陽性對照菌(單核細胞增生李斯特氏菌,伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和陰性對照菌(英諾克李斯特氏菌),穿刺時盡量接近底部,但不要觸到底面,同時避免瓊脂破裂,36 ℃±1℃培養 24 h~48 h,于明亮處觀察,單核細胞增生李斯特氏菌呈現狹窄、清晰、明亮的溶血圈,斯氏李斯特氏菌在刺種點周圍產生狹窄、微弱的溶血環,英諾克李斯特氏菌無溶血環,伊氏李斯特氏菌產生寬的、輪廓清晰的 8-溶血區域。

 
四、結果
綜合以下結果，可判定為單核細胞增生李斯特氏菌：
1、增菌后在 OA 顯色培養基（或等效培養基）和 PALCAM 培養基上形成典型菌落；
2、純培養物為灰白色、半透明、露滴狀菌落（直徑 1-2mm）；
3、糖發酵試驗為木糖陰性、鼠李糖陽性；
4、革蘭氏陽性短桿菌，有旋轉 / 翻滾樣運動；
5、動力試驗呈傘狀（或梭狀）生長；
6、過氧化氫酶陽性，且符合典型生化特征；
7、溶血試驗呈現狹窄、清晰、明亮的溶血圈。