Pipetty電動移液器在克羅諾桿菌定量檢驗中的應用

方案摘要：本方案建立基于Pipetty電動移液器的克羅諾桿菌定量檢驗方法，以最大可能數（MPN）法為核心，結合選擇性增菌、特異性分離及生化鑒定技術實現精準定量。方案核心整合Pipetty電動移液器高精度移液優勢，搭配RAYPA培養基自動制備分裝儀，優化樣品稀釋、培養物轉移及菌落接種等關鍵環節，顯著降低人為誤差。檢驗流程遵循“BPW前增菌- mLST-Vm選擇性富集-顯色培養基分離-TSA純化-生化/PCR確證”標準化步驟，最終依據不同稀釋度陽性管數查MPN檢索表，報告100g（mL）樣品中目標菌MPN值。該方法為食品等領域克羅諾桿菌污染防控提供高效可靠的檢驗技術支持。
 
方案詳情：
一、實驗原理
      克羅諾桿菌定量檢驗基于 MPN（最大可能數）法原理，結合選擇性增菌、特異性分離及精準鑒定實現定量。先以 BPW 培養基前增菌，為少量目標菌提供生長環境；再用 mLST-Vm 選擇性培養基抑制雜菌、富集目標菌。借助顯色培養基分離可疑菌落，挑取后經 TSA 純化，通過生化反應驗證典型特征，可選 PCR 靶向 ITS 區域確認。最終依據不同稀釋度陽性管數查 MPN 檢索表，報告 100g (mL) 樣品中目標菌 MPN 值。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下：
① Pipetty 電動移液器；
② 恒溫培養箱:36 ℃士1 ℃,41.5 ℃±1℃；
③ 冰箱:2 ℃~5 ℃,-20 ℃；
④ 恒溫水浴箱:41.5 ℃±1℃；
⑤ 天平:感量 0.1g、0.01g；
⑥ 振蕩器；
⑦ 無菌容器:容量 100mL、200mL、2000 mL；
⑧ 無菌培養皿:直徑90mm；
⑨ pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙；
⑩ 微生物生化鑒定系統；
⑪ PCR儀；
⑫ 離心機:轉速≥12000r/min；
⑬ 凝膠成像系統或紫外檢測儀；
⑭ 瓊脂糖水平電泳儀或毛細管電泳儀；
⑮ PCR反應管；
⑯ RAYPA培養基自動制備分裝儀；
 
2、試劑和材料
① 緩沖蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)；
② 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium,mLST-Vm)；
③ 克羅諾桿菌顯色培養基；
④ 胰蛋白胨大豆瓊脂(trypticase soy agar,TSA)；
⑤ 生化鑒定試劑盒；
⑥ 氧化酶試劑；
⑦ L-賴氨酸脫羧酶培養基；
⑧ L-鳥氨酸脫羧酶培養基；
⑨ L-精氨酸雙水解酶培養基；
⑩ 糖類發酵培養基；
⑪ 西蒙氏檸檬酸鹽培養基；
⑫ 克羅諾桿菌質控菌株；
⑬ 大腸埃希氏菌質控菌株；
 
三、實驗步驟
1、取檢樣 100 g(mL)、10 g(mL)、1 g(mL)各3份,分別置無菌容器中,分別加入 900mL、90mL、9mL已預熱至 41 ℃±1 ℃的BPW,用手緩緩地搖動至檢樣充分溶解,制成1∶10樣品勻液,36 ℃±1 ℃培養 18 h±2 h。輕輕搖動混勻培養過的前增菌液,分別移取1mL,轉入 10 mL mLST-Vm 肉湯，41.5 ℃±1 ℃培養 24 h±2 h。
2、分離培養
① 提前使用RAYPA培養基自動制備分裝儀制備克羅諾桿菌顯色培養基平板，設置分裝體積20mL/皿，確保培養基厚度4mm±0.2mm，滅菌后冷卻至45℃以下，自動分裝至培養皿中，凝固后備用�；靹� LST-Vm 肉湯培養物，用 Pipetty 電動移液器精準吸取 10μL培養物。將吸取的培養物分別劃線接種于2個克羅諾桿菌顯色培養基平板。36℃±1℃培養 24h±2h。
 
② 按顯色培養基判定標準挑取可疑菌落，每個平板至少挑 5 個（不足則全挑），用 Pipetty輔助接種，分別劃線接種 TSA 平板，36℃±1℃培養 24h±2h 備用。
3、確證實驗：將可疑菌落接種 TSA平板后進行生化鑒定�？梢允紫辱b定克羅諾桿萌顯色培養基平板上最具特征性的菌落接種的 TSA 平板上的菌落。如果是陽性,則不需要測試其他TSA 平板上的菌落。如果是陰性,則選取其他 TSA 平板上的菌落進行鑒定,直到全部為陰性或發現陽性菌落為止。為確保結果的準確性,對 TSA 平板上的菌落進行鑒定時,應使用新鮮的傳代菌落。克羅諾桿菌的主要生化特征見表3。
 
四、結果報告
綜合菌落特征、確證試驗(生化鑒定)結果,根據檢出克羅諾桿菌的陽性管數,查 MPN檢索表,報告 100 g(mL)樣品中克羅諾桿菌的 MPN 值。