RAYPA在食品單核細胞增生李斯特氏菌平板計數法的應用

方案摘要：本方案圍繞單核細胞增生李斯特氏菌檢測流程，以 RAYPA 培養基自動制備分裝儀為核心優化載體，重構檢測全流程。核心聚焦培養基制備分裝環節，通過儀器實現原料溶解、滅菌、降溫、分裝一體化操作，以參數精準控制、全封閉無菌流程、批量高效制備，保障培養基質量一致性與無菌性。依托儀器制備的標準化平板，減少人工誤差。整體流程通過儀器賦能，實現降本增效、數據精準可靠，適配高通量檢測需求，顯著提升檢測流程的規范性與結果可信度。
 
方案詳情：
一、實驗原理
      本試驗基于單核細胞增生李斯特氏菌的生理特性與特異性培養基顯色反應實現檢測。采用 OA 李斯特氏菌顯色培養基（或等效培養基），其含目標菌特異性代謝底物，該菌生長代謝時可分解底物產生特征顯色菌落，實現與其他菌的初步區分。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① RAYPA培養基自動制備分裝儀；
② Pipetty Pro 非等量電動移液器MSIC12-01-1000；
③ 恒溫培養箱:30 ℃±1 ℃、36 ℃±1℃、25 ℃~30 ℃
④ 均質器。
⑤ 顯微鏡:100 x~1 000 x。
⑥ 電子天平:感量為 0.1 g、0.1 mg。2.5
⑦ 錐形瓶:100 mL、500 mL。
⑧ 無菌培養皿:直徑 90 mm。
⑨ 無菌試管:16 mm x 160 mm。
⑩ 離心機:4 000 r/min。
⑪ 無菌離心管:30 mm x 100 mm。
⑫ 無菌涂布棒。
⑬ 單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC 19111 ；
⑭ 英諾克李斯特氏菌(Listeria innocua)ATCC 33090 ；
⑮ 伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)ATCC 19119；
⑯ 斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri)ATCC 35967；
⑰ 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923 ；
⑱ 馬紅球菌(Rhodococcus equi)ATCC 6939 ；
⑲ 小鼠:ICR 品系,體重 18 g~22 g。
⑳ 微生物生化鑒定系統及無菌過濾裝置。
 
2、試劑和材料
① 含 0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)；
② 含 0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)；
③ Fraser 增菌肉湯(FB,、FB,)；
④ OA李斯特氏菌顯色培養基；
⑤ PALCAM 培養基；
⑥ 革蘭氏染色液；
⑦ SIM 動力培養基；
⑧ 緩沖葡萄糖蛋白胨水；
⑨ 羊血瓊脂；
⑩ 無菌磷酸鹽緩沖液；
⑪ 無菌生理鹽水；
⑫ 糖發酵管；
⑬ 過氧化氫試劑；
⑭ 微生物生化鑒定試劑盒。
 
三、實驗步驟
1、提前啟動RAYPA培養基自動制備分裝儀，將試驗所需的培養基，肉湯，蛋白胨水制備并精準分裝保存至玻璃瓶或無菌培養皿內。
 
2、根據對樣品污染狀況的估計,選擇2個~3個適宜連續稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),每個稀釋度分別吸取 0.1mL樣品勻液,接種1個OA李斯特氏菌顯色培養基平板。并用無菌涂布棒涂布整個平板,注意不要觸及平板邊緣。使用前,如瓊脂平板表面有水珠,可放在 25 ℃~50 ℃的培養箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。
注:必要時,每個稀釋度可做重復試驗。
3、對于單核細胞增生李斯特氏菌含量較低的食品樣品,使用Pipetty Pro 非等量電動移液器，預設好單次分液量后，一次性吸取1mL最低稀釋度樣品勻液,以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接種量分別涂布于3塊 OA李斯特氏菌顯色培養基平板。
注：從樣品稀釋至樣品接種完畢不得超過 45 min。
 
4、涂布后,將平板正置于水平桌上 10 min~20 min后翻轉平皿,放入培養箱培養,36 ℃±1℃ 培養 24 h~48 h。
5、如果樣液不易吸收,可將平板正置在培養箱 36 ℃±1 ℃培養1h,等樣品勻液吸收后再翻轉平皿,倒置于培養箱,36 ℃±1 ℃繼續培養 24 h~48 h。
6、選擇有典型或可疑單核細胞增生李斯特氏菌菌落生長的平板,如果:
a) 只有1個稀釋度的平板合計典型或可疑菌落數在 15 CFU~150 CFU之間,應計數該稀釋度平板上的典型或可疑菌落數;
b) 所有稀釋度的平板合計典型或可疑菌落數均小于15 CFU,應計數最低稀釋度平板上的典型或可疑菌落數;
c) 所有稀釋度的平板合計典型或可疑菌落數大于150 CFU,應計數最高稀釋度平板上的典型或。可疑菌落數;
d) 所有稀釋度的合計平板典型或可疑菌落數均不在 15 CFU~150 CFU 之間,其中一部分小于15 CFU 或大于 150 CFU 時,應計數最接近 15 CFU 或 150 CFU的稀釋度平板上的典型或可疑菌落數;符合 a)~d)者按式(1)計算。
 
e) 2個連續稀釋度的合計平板典型或可疑菌落數均在 15 CFU~150 CFU 之間,按式(2)計算。
 
6、從每個平板中挑取5個典型或可疑菌落(少于5個全選),進行鑒定。
 
四、結果報告
1、菌落數小于 100 CFU 時,按“四舍五入”原則修約,以整數報告。
2、菌落數大于或等于 100 CFU 時,第3位數字采用“四舍五入”原則修約后,取前兩位數字,后面用0代替位數。也可用10的指數形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,保留兩位有效數字。
3、 報告每g(mL)樣品中單核細胞增生李斯特氏菌菌落數,以 CFU/g(mL)表示;如T值為 0,接種量采用 0.1 mL,方法的以小于 10 乘以最低稀釋倍數報告。接種量采用 0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL方法的以小于1乘以最低稀釋倍數報告。