RAYPA在食品單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法的應(yīng)用

方案摘要：本方案圍繞單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測流程，以 RAYPA 培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀為核心優(yōu)化載體，重構(gòu)檢測全流程。核心聚焦培養(yǎng)基制備分裝環(huán)節(jié)，通過儀器實(shí)現(xiàn)原料溶解、滅菌、降溫、分裝一體化操作，以參數(shù)精準(zhǔn)控制、全封閉無菌流程、批量高效制備，保障培養(yǎng)基質(zhì)量一致性與無菌性。依托儀器制備的標(biāo)準(zhǔn)化平板，減少人工誤差。整體流程通過儀器賦能，實(shí)現(xiàn)降本增效、數(shù)據(jù)精準(zhǔn)可靠，適配高通量檢測需求，顯著提升檢測流程的規(guī)范性與結(jié)果可信度。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
      本試驗(yàn)基于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生理特性與特異性培養(yǎng)基顯色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)檢測。采用 OA 李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基（或等效培養(yǎng)基），其含目標(biāo)菌特異性代謝底物，該菌生長代謝時(shí)可分解底物產(chǎn)生特征顯色菌落，實(shí)現(xiàn)與其他菌的初步區(qū)分。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀；
② Pipetty Pro 非等量電動(dòng)移液器MSIC12-01-1000；
③ 恒溫培養(yǎng)箱:30 ℃±1 ℃、36 ℃±1℃、25 ℃~30 ℃
④ 均質(zhì)器。
⑤ 顯微鏡:100 x~1 000 x。
⑥ 電子天平:感量為 0.1 g、0.1 mg。2.5
⑦ 錐形瓶:100 mL、500 mL。
⑧ 無菌培養(yǎng)皿:直徑 90 mm。
⑨ 無菌試管:16 mm x 160 mm。
⑩ 離心機(jī):4 000 r/min。
⑪ 無菌離心管:30 mm x 100 mm。
⑫ 無菌涂布棒。
⑬ 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC 19111 ；
⑭ 英諾克李斯特氏菌(Listeria innocua)ATCC 33090 ；
⑮ 伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)ATCC 19119；
⑯ 斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri)ATCC 35967；
⑰ 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923 ；
⑱ 馬紅球菌(Rhodococcus equi)ATCC 6939 ；
⑲ 小鼠:ICR 品系,體重 18 g~22 g。
⑳ 微生物生化鑒定系統(tǒng)及無菌過濾裝置。
 
2、試劑和材料
① 含 0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)；
② 含 0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)；
③ Fraser 增菌肉湯(FB,、FB,)；
④ OA李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基；
⑤ PALCAM 培養(yǎng)基；
⑥ 革蘭氏染色液；
⑦ SIM 動(dòng)力培養(yǎng)基；
⑧ 緩沖葡萄糖蛋白胨水；
⑨ 羊血瓊脂；
⑩ 無菌磷酸鹽緩沖液；
⑪ 無菌生理鹽水；
⑫ 糖發(fā)酵管；
⑬ 過氧化氫試劑；
⑭ 微生物生化鑒定試劑盒。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、提前啟動(dòng)RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀，將試驗(yàn)所需的培養(yǎng)基，肉湯，蛋白胨水制備并精準(zhǔn)分裝保存至玻璃瓶或無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。
 
2、根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),選擇2個(gè)~3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),每個(gè)稀釋度分別吸取 0.1mL樣品勻液,接種1個(gè)OA李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板。并用無菌涂布棒涂布整個(gè)平板,注意不要觸及平板邊緣。使用前,如瓊脂平板表面有水珠,可放在 25 ℃~50 ℃的培養(yǎng)箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。
注:必要時(shí),每個(gè)稀釋度可做重復(fù)試驗(yàn)。
3、對(duì)于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌含量較低的食品樣品,使用Pipetty Pro 非等量電動(dòng)移液器，預(yù)設(shè)好單次分液量后，一次性吸取1mL最低稀釋度樣品勻液,以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接種量分別涂布于3塊 OA李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板。
注：從樣品稀釋至樣品接種完畢不得超過 45 min。
 
4、涂布后,將平板正置于水平桌上 10 min~20 min后翻轉(zhuǎn)平皿,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),36 ℃±1℃ 培養(yǎng) 24 h~48 h。
5、如果樣液不易吸收,可將平板正置在培養(yǎng)箱 36 ℃±1 ℃培養(yǎng)1h,等樣品勻液吸收后再翻轉(zhuǎn)平皿,倒置于培養(yǎng)箱,36 ℃±1 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 24 h~48 h。
6、選擇有典型或可疑單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落生長的平板,如果:
a) 只有1個(gè)稀釋度的平板合計(jì)典型或可疑菌落數(shù)在 15 CFU~150 CFU之間,應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型或可疑菌落數(shù);
b) 所有稀釋度的平板合計(jì)典型或可疑菌落數(shù)均小于15 CFU,應(yīng)計(jì)數(shù)最低稀釋度平板上的典型或可疑菌落數(shù);
c) 所有稀釋度的平板合計(jì)典型或可疑菌落數(shù)大于150 CFU,應(yīng)計(jì)數(shù)最高稀釋度平板上的典型或。可疑菌落數(shù);
d) 所有稀釋度的合計(jì)平板典型或可疑菌落數(shù)均不在 15 CFU~150 CFU 之間,其中一部分小于15 CFU 或大于 150 CFU 時(shí),應(yīng)計(jì)數(shù)最接近 15 CFU 或 150 CFU的稀釋度平板上的典型或可疑菌落數(shù);符合 a)~d)者按式(1)計(jì)算。
 
e) 2個(gè)連續(xù)稀釋度的合計(jì)平板典型或可疑菌落數(shù)均在 15 CFU~150 CFU 之間,按式(2)計(jì)算。
 
6、從每個(gè)平板中挑取5個(gè)典型或可疑菌落(少于5個(gè)全選),進(jìn)行鑒定。
 
四、結(jié)果報(bào)告
1、菌落數(shù)小于 100 CFU 時(shí),按“四舍五入”原則修約,以整數(shù)報(bào)告。
2、菌落數(shù)大于或等于 100 CFU 時(shí),第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前兩位數(shù)字,后面用0代替位數(shù)。也可用10的指數(shù)形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,保留兩位有效數(shù)字。
3、 報(bào)告每g(mL)樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落數(shù),以 CFU/g(mL)表示;如T值為 0,接種量采用 0.1 mL,方法的以小于 10 乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。接種量采用 0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL方法的以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。