RAYPA在食品單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)中的應(yīng)用

方案摘要：方案針對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測，整合 RAYPA 培養(yǎng)基自動制備分裝儀核心優(yōu)勢，優(yōu)化檢測全流程。儀器實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基溶解、滅菌、恒溫?cái)嚢琛⒕珳?zhǔn)分裝一體化操作，可自動完成 FB 增菌肉湯、OA 顯色培養(yǎng)基等多類培養(yǎng)基制備，控溫精準(zhǔn)、分裝誤差小，保障培養(yǎng)基成分均一性。同時，減少手動操作帶來的污染風(fēng)險(xiǎn)與人為誤差，批量制備效率提升 40% 以上。流程以自動化培養(yǎng)基制備為基礎(chǔ)，銜接樣品增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定等環(huán)節(jié)，既符合 GB 4789.30-2025 標(biāo)準(zhǔn)要求，又適配規(guī)模化檢測需求，實(shí)現(xiàn)檢測高效性與結(jié)果可靠性的雙重保障。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
      通過增菌培養(yǎng)富集目標(biāo)菌，利用選擇性培養(yǎng)基分離單菌落，結(jié)合形態(tài)特征、生化反應(yīng)及溶血特性等進(jìn)行綜合鑒定，最終確認(rèn)是否存在單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① RAYPA培養(yǎng)基自動制備分裝儀；
② 冰箱；
③ 恒溫培養(yǎng)箱:30 ℃±1 ℃、36 ℃±1℃、25 ℃~30 ℃
④ 均質(zhì)器。
⑤ 顯微鏡:100 x~1 000 x。
⑥ 電子天平:感量為 0.1 g、0.1 mg。2.5
⑦ 錐形瓶:100 mL、500 mL。
⑧ 無菌培養(yǎng)皿:直徑 90 mm。
⑨ 無菌試管:16 mm x 160 mm。
⑩ 離心機(jī):4 000 r/min。
⑪ 無菌離心管:30 mm x 100 mm。
⑫ 無菌涂布棒。
⑬ 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC 19111 ；
⑭ 英諾克李斯特氏菌(Listeria innocua)ATCC 33090 ；
⑮ 伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)ATCC 19119；
⑯ 斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri)ATCC 35967；
⑰ 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923 ；
⑱ 馬紅球菌(Rhodococcus equi)ATCC 6939 ；
⑲ 小鼠:ICR 品系,體重 18 g~22 g。
⑳ 微生物生化鑒定系統(tǒng)及無菌過濾裝置。
 
2、試劑和材料
① 含 0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)；
② 含 0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)；
③ Fraser 增菌肉湯(FB,、FB,)；
④ OA李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基；
⑤ PALCAM 培養(yǎng)基；
⑥ 革蘭氏染色液；
⑦ SIM 動力培養(yǎng)基；
⑧ 緩沖葡萄糖蛋白胨水；
⑨ 羊血瓊脂；
⑩ 無菌磷酸鹽緩沖液；
⑪ 無菌生理鹽水；
⑫ 糖發(fā)酵管；
⑬ 過氧化氫試劑；
⑭ 微生物生化鑒定試劑盒。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、使用RAYPA培養(yǎng)基自動制備分裝儀，提前制備試驗(yàn)所需的各類培養(yǎng)基并分裝至無菌培養(yǎng)皿，靜置凝固備用。
 
2、以無菌操作取 25 g(mL)樣品,置于盛有 225 mL FB,增菌肉湯的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000 r/min~10 000 r/min 均質(zhì)1 min~2 min,或放入盛有 225 mL FB,增菌肉湯的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打 1 min~2 min,制成1:10 的樣品勻液。若樣品為液態(tài),也可采用振蕩或攪拌混勻。于 30 ℃±1℃培養(yǎng) 24 h±2 h。使用Pipetty電動移液器，混勻,吸取 0.1 mL FB,增菌肉湯,轉(zhuǎn)種于 10 mL FB,增菌肉湯內(nèi)。于 30 ℃±1℃培養(yǎng)24 h±2 h。
3、取混勻后的 FB,增菌肉湯,分別接種于用RAYPA培養(yǎng)基制備分裝儀提前分裝好的 OA李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板和 PALCAM 培養(yǎng)基平板,36 ℃±1℃ 培養(yǎng) 24 h~48h,觀察各個平板上生長的菌落。典型菌落在 OA李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板上形成直徑為1mm~3 mm 的圓形藍(lán)綠色菌落,周圍有不透明的暈圈。典型菌落在 PALCAM 培養(yǎng)基平板上形成直徑為1mm~3 mm 的圓形灰綠色菌落,周圍有棕黑色水解圈,培養(yǎng) 48h后,部分菌落中心形成黑點(diǎn)且有凹陷。其他等效李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板上的菌落特征參照產(chǎn)品說明進(jìn)行判定。
注 1:一些單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在 OA李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上的菌落周圍的暈圈不明顯甚至沒有暈圈。還有一些單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在 OA李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上的菌落周圍的暈圈出現(xiàn)得比較遲緩,有時需要 4d 以上才出現(xiàn)。
注 2:伊氏李斯特氏菌在 OA李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)與單核細(xì)胞增生李斯特氏菌相似,
4、從每個平板中挑取3個~5 個典型或可疑菌落(少于3個全選),在 TSA-YE平板或羊血平板上劃線,于36℃±1 ℃培養(yǎng)18h~24 h。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在 TSA-YE平板或羊血平板上,呈灰白色,半透明,邊緣整齊,露滴狀菌落、直徑為1 mm~2 mm。
 
5、篩選與鑒定
① 挑取 TSA-YE平板或羊血平板上的單個菌落,接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管,于36℃±1℃培養(yǎng) 24 h±2 h，同時在 TSA-YE平板或羊血平板上劃線,于 36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h~24 h,以獲取下一步鑒定用的純培養(yǎng)物。然后選擇木糖陰性,鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。
② 鏡檢:挑取 18 h~24 h純培養(yǎng)的單個菌落做革蘭氏染色鏡檢,李斯特氏菌為革蘭氏陽性短桿菌,大小為(0.4 μm~0.5 μm)X(0.5 μm~2.0 μm)。用生理鹽水制成菌懸液,在油鏡或相差顯微鏡下觀察該菌出現(xiàn)輕微旋轉(zhuǎn)或翻滾樣的運(yùn)動。
③ 動力試驗(yàn):挑取 18 h~24h純培養(yǎng)的單菌落穿刺半固體或 SIM 動力培養(yǎng)基,于25 ℃~30 ℃培養(yǎng) 48 h±2 h。李斯特氏菌沿穿刺線以不規(guī)則的云霧狀向四周延伸生長,培養(yǎng)基表面下3mm~5 mm處形成一似傘狀(或梭狀)界面。如傘狀(或梭狀)生長不明顯,可繼續(xù)培養(yǎng),每天觀察結(jié)果1次,觀察5 d。
④ 生化鑒定:挑取 18 h~24h純培養(yǎng)的單個菌落,進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn),過氧化氫酶陽性反應(yīng)的菌落繼續(xù)進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、MR-VP試驗(yàn)。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的主要生化特征見表 1。
⑤ 溶血試驗(yàn):將新鮮的羊血瓊脂平板底面劃分為 20個~25 個小格,挑取 18 h~24h純培養(yǎng)的單個菌落刺種到血平板上,每格刺種1個菌落,并刺種陽性對照菌(單核細(xì)胞增生李斯特氏菌,伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和陰性對照菌(英諾克李斯特氏菌),穿刺時盡量接近底部,但不要觸到底面,同時避免瓊脂破裂,36 ℃±1℃培養(yǎng) 24 h~48 h,于明亮處觀察,單核細(xì)胞增生李斯特氏菌呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的溶血圈,斯氏李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周圍產(chǎn)生狹窄、微弱的溶血環(huán),英諾克李斯特氏菌無溶血環(huán),伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的 8-溶血區(qū)域。

 
四、結(jié)果
綜合以下結(jié)果，可判定為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌：
1、增菌后在 OA 顯色培養(yǎng)基（或等效培養(yǎng)基）和 PALCAM 培養(yǎng)基上形成典型菌落；
2、純培養(yǎng)物為灰白色、半透明、露滴狀菌落（直徑 1-2mm）；
3、糖發(fā)酵試驗(yàn)為木糖陰性、鼠李糖陽性；
4、革蘭氏陽性短桿菌，有旋轉(zhuǎn) / 翻滾樣運(yùn)動；
5、動力試驗(yàn)呈傘狀（或梭狀）生長；
6、過氧化氫酶陽性，且符合典型生化特征；
7、溶血試驗(yàn)呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的溶血圈。