Pipetty電動移液器在肝素凝血時間測定（兔全血法）中的應用

方案摘要：本方案旨在檢測肝素抗凝活性，為提升實驗室液體處理的精準性與效率，引入 Pipetty 電動移液器。依托其專利溫度控制技術，通過內置傳感器實時校正手部熱量導致的誤差，完美適配高精度實驗需求。筆式操作設計大幅降低手部勞損，避免腱鞘炎風險。一鍵連續分液功能可將重復移液時間縮短 1/2 至 2/3，且適配主流品牌吸頭，無需額外采購成本。該設備能消除人工操作差異，保障實驗重復性，同時提升工作效率，為科研質量與人員體驗雙重賦能。
 
方案詳情：
一、實驗原理
      肝素凝血時間測定（兔全血法）是體外評估肝素抗凝活性的實驗方法，原理核心圍繞肝素的抗凝機制展開：肝素可與抗凝血酶（AT）特異性結合，顯著增強 AT 對凝血酶（Ⅱa 因子）、因子 Ⅹa 等關鍵凝血因子的抑制活性，進而阻斷凝血級聯反應，延緩血液凝固。將定量稀釋的肝素與新鮮兔全血混合，在 37℃恒溫條件下，觀察血液從液態到凝固的時間。正常兔全血有固有凝血時間，加入肝素后，其凝固時間會隨肝素活性 / 濃度升高而延長，通過對比可量化肝素抗凝效果，同時設生理鹽水空白對照排除干擾。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-1000、MSIC90-001-10mL；
② 恒溫水浴箱 37℃±0.5℃；
③ 離心管、96 孔酶標板（平底，透明）；
④ 采血針。
 
2、試劑和材料
① 肝素標準品；
② 供試品；
③ 氯化鈉注射液；
④ 兔血漿；
⑤ 枸椽酸鈉溶液。
 
 
三、實驗步驟
1、標準品溶液的制備：精密稱取肝素標準品適量，按標示效價加滅菌注射用水溶解使成每1mL中含100單位的溶液，分裝于適宜的容器內，4～8℃貯存。
2、標準品稀釋液的制備：試驗當日，使用電動移液器，精密量取標準品溶液，按高、中、低劑量組（dS₃、dS₂、dS₁）用氯化鈉注射液配制成3種濃度的稀釋液，相鄰兩濃度的比值（r）應相等；調節劑量使低劑量組各管的平均凝結時間較不加肝素對照管明顯延長，一般以大于1.5倍空白血漿的凝結時間為宜。高劑量組各管的平均凝結時間，以不超過60分鐘為宜，其稀釋液一般可制成每1mL中含肝素2～5單位，r為1∶0.7左右；
　3、供試品溶液與稀釋液的制備：按供試品的標示量或估計效價（AT），制成高、中、低(dT₃、dT₂、dT₁）3種濃度的稀釋液。相鄰兩濃度之比值（r）應與標準品相等，供試品與標準品各劑量組的凝結時間應相近。
　　4、血漿的制備：迅速收集兔或豬血置預先放有109mmol/L枸椽酸鈉溶液的容器中，枸椽酸鈉溶液與血液容積比為1∶9，邊收集邊輕輕振搖，混勻，室溫下1500×g離心不少于15分鐘（g為重力常數）。立即吸出血漿，并分成若干份分裝于適宜容器內，低溫凍結貯存。臨用時置37℃±0.5℃水浴中融化，用兩層紗布或快速濾紙過濾，使用過程中在4～8℃放置。
　5、取管徑均勻、清潔干燥的小試管若干支，使用Pipetty電動移液器，設置連續分液模式，每管加入一種濃度的標準品或供試品稀釋液0.lmL，每種濃度3管。取剛抽出的兔血適量，分別注入小試管內，每管0.9mL，立即混勻,避免產生氣泡，并開始計算時間。將小試管置37℃±0.5℃恒溫水浴中，從動物釆血時起至小試管放入恒溫水浴的時間不得超過3分鐘，注意觀察并記錄各管的凝結時間。
 
四、結果判定
1、迅速將混勻后的試管放回 37℃恒溫水箱，保持試管垂直靜置，避免觸碰。從計時開始，每隔 30 秒輕輕取出試管，緩慢傾斜 45°（動作輕柔，避免晃動），觀察血液流動性：
若血液仍呈液態、可沿管壁流動，立即放回水箱繼續觀察；
若血液不再流動、管壁出現凝固絮狀物（或形成半固體狀），立即停止秒表，記錄此時的時間（即為該濃度肝素的 “凝血時間”）。
2、本法的可信限率（FL%）不得大于10%。