Pipetty電動移液器在肝素產品效價測定（抗Ⅱa因子測定法 ）中的應用

方案摘要：肝素生物測定中的抗 Ⅱa 因子測定法，是基于肝素對凝血因子 Ⅱa（即凝血酶）的特異性抑制作用，定量檢測肝素（尤其是普通肝素、低分子肝素）生物活性的關鍵方法，其核心優勢是直接反映肝素的抗凝生物效應（而非單純化學含量），是臨床監測和藥品質量控制的重要手段。為提升試驗效率，本方案采用了Pipetty電動移液器，核心優勢集中于提升操作精度與效率、降低人為誤差，精準度高，通過電動驅動系統實現 0.1μL 級增量調節，避免手動按壓力度不均導致的移液偏差；支持連續分液模式，批量處理 96 孔板等樣本時效率較手動提升 3 倍以上；機身體積小重量輕，可降低長時間操作疲勞感，同時兼容多種規格吸頭，適配不同實驗試劑需求，全方位保障實驗結果可靠性與操作便捷性。
 
方案詳情：
一、實驗原理
       該方法核心是基于肝素對凝血因子 Ⅱa（凝血酶）的間接抑制作用定量其生物活性。肝素本身無直接抑酶活性，需先與血漿中抗凝血酶（AT）結合，誘導 AT 構象改變并激活，形成的 “肝素 - AT 復合物” 對 Ⅱa 因子親和力顯著提升，可快速結合 Ⅱa 因子形成三元復合物，使其失去催化纖維蛋白原轉化為纖維蛋白的凝血功能。實驗中加入已知量的 AT 和 Ⅱa 因子，肝素濃度越高，被抑制的 Ⅱa 因子越多，剩余 Ⅱa 活性越低。通過加入特異性發色底物，剩余 Ⅱa 因子可水解底物產生有色產物，其吸光度與剩余 Ⅱa 活性正相關。借助肝素標準品繪制 “吸光度 - 濃度” 標準曲線，即可反推出待檢樣本中肝素的生物活性濃度，直接反映其抗凝效應。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250；
② 恒溫水浴箱 37℃±0.5℃；
③ 酶標儀；
④ 離心管、96 孔酶標板（平底，透明）；
⑤ 渦旋振蕩器。
 
2、試劑和材料
① 三羥甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000緩沖液；
② 抗凝血酶溶液；
③ 凝血酶溶液；
④ 發色底物溶液；
⑤ 肝素標準品；
⑥ 供試品。
 
 
三、實驗步驟
1、制備供試品溶液與稀釋液：按供試品的標示量或估計效價（AT），用三羥甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000緩沖液（pH8.4），制成4個不同濃度的溶液，相鄰兩濃度之比值（r）應與標準品相等，供試品與標準品各劑量組的反應值應相近。
2、取不同濃度的標準品（S）系列溶液或供試品（T）系列溶液及上述緩沖液（B），按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的順序，試用Pipetty電動 移液器，設置連續分液模式，依次向酶標板各孔中分別加入20μL的上述溶液,每個濃度做三個復孔；
 
3、使用連續分液模式，每孔加入20μL的抗凝血酶溶液，混勻模式，自動混勻，37℃平衡2分鐘；
4、再加入凝血酶溶液20μL，自動混勻，37℃平衡2分鐘；
5、再加入發色底物溶液20μL，自動混勻，37℃準確保溫2分鐘后，再精密加入50%醋酸溶液20μL，終止反應后，迅速冷卻至室溫。
四、結果判定
1、用酶標儀在405nm的波長處測定各孔的吸光度。B1、B2兩孔的吸光度不得有顯著性差異。以吸光度為縱坐標，標準品系列溶液（或供試品系列溶液）濃度的對數值為橫坐標分別作線性回歸，按生物檢定統計法（通則1431）中的量反應平行線原理4.4法實驗設計，計算效價及實驗誤差。
2、本法的可信限率（FL%）不得大于10%。