Pipetty電動移液器在狂犬病毒檢測（巢式RT-PCR）中的應用

方案摘要：本方案采用巢式逆轉錄 PCR（巢式 RT-PCR）技術，實現對狂犬病毒的高敏感、高特異檢測。適用于人類生前篩查（唾液、腦脊液等）及死后確診（腦組織），亦用于動物狂犬病溯源。結合 Pipetty 電動移液器操作，其精準的移液精度可減少 RNA 提取及 PCR 體系配制中的人為誤差，穩定的移液速度避免樣本飛濺導致的交叉污染，提升批量樣本處理的一致性與效率。該方案結合電動移液器優勢，可高效支持狂犬病確診、動物溯源，為防控提供可靠依據。
 
方案詳情：
一、實驗原理
       狂犬病毒為單鏈負鏈 RNA 病毒，無法直接用常規 PCR 擴增，故采用巢式 RT-PCR 檢測，核心是 “逆轉錄 + 兩輪遞進擴增”。首先通過逆轉錄酶將病毒 RNA 轉化為可擴增的 cDNA；接著第一輪 PCR 用外引物（針對病毒保守基因如 N 基因）擴增 cDNA，得到初步產物；再取少量首輪產物，用結合于首輪產物內部的內引物進行第二輪 PCR。兩輪擴增使目標片段放大 10⁴-10⁶倍，大幅提升敏感性（可檢出低至 10 拷貝 /mL 的病毒 RNA），且內引物僅擴特異片段，徹底排除非特異擴增，顯著提高檢測特異性，適配生前低載量樣本（如唾液）及死后樣本的狂犬病毒檢測。
 
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② A2 型生物安全柜；
③ 小型臺式冷凍離心機；
④ PCR 儀；
⑤ 水平電泳儀；
⑥ 凝膠成像儀；
⑦ 組織勻漿器等。
 
2、試劑和材料
① 狂大病病毒陽性對照腦組織；
② 狂大病病毒陰性對照腦組織；
③  特異性擴增引物：
外套上游引物F1:5-GTGTAACACCTCTACAATGG；
外套下游引物R1:5-ACAGTCTCYTCNGCCATCT；
內套上游引物F2:5-CAAGATGTGYGCYAAYTGGAG；
內套下游引物R2:5-AGCCCTGGTTCGAACATTCT。
④ RNA 提取試劑盒或試劑(商品化試劑)；
⑤ 一步法 RT-PCR 試劑盒或相應酶類及緩沖液(商品化試劑),包括反轉錄酶、DNA 聚合酶dNTP、反應緩沖液、無 RNA 酶水等；
⑥ PCR試劑盒或相應酶類及緩沖液(商品化試劑),包括 DNA 聚合酶、dNTP、反應緩沖液、無RNA 酶水等；
⑦ TAE 電泳及制膠緩沖液。
 
 
三、實驗步驟
1、分別從不同部位待檢腦組織(至少應包含腦干及小腦組織)各取樣品約1g，樣品量少時可取全部組織。剪碎混勻,取其中約1g置組織勻漿器中,加入1mL生理鹽水進行勻漿,以3000g離心2min 后取 100μL,勻漿上清于 1.5 mL滅菌離心管中。使用Pipetty電動移液器，狂犬病病毒陽性和陰性對照腦組織各取 100μL分別置于 1.5 mL 滅菌離心管中。唾液樣品直接取 100μL, 置于 1.5 mL滅菌離心管中。
 
2、使用Pipetty電動移液器，使用 RNA 提取試劑盒,按試劑盒說明書提取待檢樣品和對照樣品總 RNA。
3、用無 RNA 酶水將引物溶解或稀釋至濃度 10 μmol/L。
4、PCR 擴增
a）外套擴增：使用一步法 RT-PCR 試劑盒,按說明書配制反應體系,進行擴增條件設置。50 ℃反轉錄 30 min;95 ℃預變性 2 min; 95 ℃變性 30 s,55 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 90 s,30 個循環;72 ℃終延伸 5 min。
b)內套擴增：使用 PCR 試劑盒,以外套擴增產物1μL為模板,使用Pipetty電動移液器，設置連續分液模式，按說明書配制反應體系,進行擴增條件設置。95 ℃預變性2min；95 ℃變性 30 s,55 ℃退火 30s,72 ℃延伸 30 s,30 個循環；72 ℃終延伸5 min。
 
c) 擴增產物電泳：取內套擴增產物5 μL~10 μL,加樣于含核酸染色劑的 1.0%瓊脂糖凝膠孔中,另孔加5 μL DNA Marker,以 100 V~120 V電壓于 1×TAE 電泳緩沖液中電泳約20 min,于凝膠成像儀內觀察結果。
 
 
四、結果判定
1、狂犬病病毒陽性對照樣品出現 255 bp 擴增條帶、陰性對照樣品無特異擴增條帶時,檢測結果成立。
2、被檢樣品出現 255 bp擴增條帶時判定為狂犬病病毒核酸陽性,否則判定為陰性。