Pipetty電動移液器在犬細小病毒檢測（PCR實驗）中的應用

方案摘要：PCR 檢測是犬細小病毒診斷的 “金標準”，其高敏感性、高特異性可實現早期精準診斷。在實際應用中，需嚴格把控樣本采集、處理及污染控制環節，并結合狗狗的年齡、臨床癥狀（如體溫、糞便性狀）綜合判斷，才能為治療方案制定（如補液、抗病毒、對癥支持）提供可靠依據，降低 CPV 的死亡率。當前實驗室移液操作中，人工移液存在精度波動大、批量處理效率低、交叉污染風險高的痛點，尤其在犬細小病毒 PCR 檢測等對移液精準度要求嚴苛的場景中，人工操作易因誤差導致試劑浪費、檢測結果重復性差，甚至因污染引發假陽性 / 假陰性，影響診斷準確性。使用 Pipetty電動移液器，可針對性解決上述問題，提升移液環節的標準化與可靠性。
 
方案詳情：
一、實驗原理
      犬細小病毒（CPV）PCR 檢測以病毒VP2 基因為核心靶點（該基因高度保守、無交叉同源性，確保特異性），通過體外三步溫度循環實現 CPV DNA 指數級擴增。首先 90-95℃變性，使 CPV 雙鏈 DNA 解旋為單鏈；隨后 50-65℃退火，讓特異性引物結合單鏈 VP2 基因靶點；再于 72℃延伸，Taq 酶以 dNTP 為原料合成新鏈，每輪循環使病毒 DNA 量翻倍，30-40 輪后可擴增至可檢出水平，普通PCR通過瓊脂糖凝膠電泳觀察特定條帶判讀。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② 冰箱(4℃、-20℃、-70℃)；
③ PCR 儀；
④ 高速冷凍離心機(4℃、離心速度12000r/min以上)；
⑤ 穩壓穩流電泳儀和水平電泳槽；
⑥ 凝膠成像系統；
⑦ 無DNA酶離心管與帶濾芯吸頭。
 
2、試劑和材料
① DNA isoReagent 試劑:DNA提取試劑，也可用商品化DNA提取試劑盒，或其他等效 DNA 提取試劑和方法，如自動化核酸提取儀和其他配套核酸抽提試劑進行核酸提取；
② 無水乙醇；
③ DEPC水(0.1%)；
④ PCR相關試劑:可選擇商品化試劑盒，操作步驟按照說明書進行；
⑤ Taq酶及10倍Taq酶反應緩沖液:Taq酶濃度為5U/μL，-20℃保存；
⑥ dNTP:含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10 mmol/L，-20 ℃保存；
⑦ 5×TBE電泳緩沖液。
⑧ 引物濃度:20 mol/,其序列如下：
上游引物(CPVF):5'GAA TCT GCT ACT CAG CCA CCA AC-3'；
下游引物(CPVR):5'GTG CAC TAT AAC CAA CCT CAG C-3'；
 
 
三、實驗步驟
1、用DEPC水作為CPV陰性對照，用CPV的細胞培養物作為CPV陽性對照，無酶水作為空白對照。
2、使用Pipetty電動移液器，取處理好的待檢樣品上清液500μL置于1.5mL無DNA酶離心管中，加入500μL DNAiso Reagent 試劑，顛倒混勻6次~8次，靜置約10 min后，12 000 r/min 離心 10 min。
 
3、取上清液(至少500 μL)至新的 1.5 ml無 DNA酶離心管中，每管加入 400 μL無水乙醇，顛倒混勻6次~8次，4000r/min離心2min。
4、 小心棄掉上清液，加1mL 75%(體積分數)乙醇溶液，顛倒混勻6次~8次，12000 r/min離心5 min。
5、小心棄掉上清液，倒置在干凈的吸水紙上晾干水分，加入20μL DEPC水溶解DNA沉淀。-20℃冰箱中保存備用。
注：可以使用等效的商品化試劑盒進行DNA提取。
6、使用Pipetty電動移液器，根據表1的PCR反應體系，設置單次分液模式，將除DNA模板之外的試劑按照所需孔數計算體積并×10%，移取至1.5ML離心管中，混勻模式，自動混勻。 
7、設置連續分液模式，將混合好的試劑和DNA模板分別加入到96孔板中，離心。 
8、將 PCR管置 PCR儀上按如下程序擴增:94℃預變性2min；94℃變性30s，55 ℃退火 30s，72 ℃延伸40s，進行35個循環；72 ℃延伸3 min。
9、用TBE電泳緩沖液配制1.5%的瓊脂糖平板，將凝膠平板放入水平電泳槽中，使電泳緩沖液剛好沒過膠面，使用Pipetty，將10μL PCR產物和2μL加樣緩沖液(6X)，混勻后加入樣品孔。
10、電泳時應設立DNA分子質量標準對照。
11、在120V、90mA條件下電泳約30min，電泳結束后，用凝膠成像系統觀察結果
四、結果判定
1、CPV陽性對照樣品擴增出大小為559bp的核酸片段，且陰性對照樣品無擴增條帶，判定陰、陽性對照成立；否則試驗結果無效。
2、在陰、陽性對照成立條件下，若待檢樣品擴增出大小為559bp的核酸片段，判為CPV核酸陽性；若待檢樣品無擴增條帶或擴增條帶大小不為559bp，判為CPV核酸陰性。