Fiber-seq：利用HiFi長(zhǎng)讀長(zhǎng)技術(shù)，一次測(cè)序?qū)崿F(xiàn)多重檢測(cè)

長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)，例如 PacBio HiFi 測(cè)序，正在迅速成為基因組學(xué)研究的新黃金標(biāo)準(zhǔn)。

長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序是一種核酸測(cè)序類(lèi)型，它能夠產(chǎn)生單獨(dú)的讀取（read），這些 read 各自來(lái)自于一個(gè)長(zhǎng)度為數(shù)千個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)的單個(gè)DNA分子，從而生成基因組數(shù)據(jù)。長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序能夠檢測(cè)長(zhǎng)度為1,000到20,000個(gè)堿基或更長(zhǎng)的DNA（或RNA）片段。這些片段通常來(lái)自于“原生”分子，這些分子是直接從生物樣本中提取出來(lái)進(jìn)行分析的。相比之下，大多數(shù)短讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)只能檢測(cè)50-300個(gè)堿基長(zhǎng)度的片段。與大多數(shù)長(zhǎng)讀長(zhǎng)方法不同，短讀長(zhǎng)測(cè)序解決方案無(wú)法有效地對(duì)原生分子進(jìn)行測(cè)序，并且在分析之前需要對(duì)提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

PacBio 測(cè)序技術(shù)是一種進(jìn)階版長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)，稱(chēng)為高度準(zhǔn)確的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序或 HiFi reads。目前僅有 PacBio 可提供準(zhǔn)確度 > 99.9% 的 HiFi reads 測(cè)序技術(shù)，其準(zhǔn)確度與短讀長(zhǎng)測(cè)序和 Sanger 測(cè)序相當(dāng)。HiFi reads 可以讓您在解決棘手的生物學(xué)問(wèn)題時(shí)，無(wú)需再以犧牲讀長(zhǎng)為代價(jià)換取高準(zhǔn)確度測(cè)序。

Fiber-seq

Fiber-seq 是一種多組學(xué)長(zhǎng)讀長(zhǎng)檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記開(kāi)放染色質(zhì) + PacBio HiFi 長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序，在單分子水平同時(shí)讀出基因組序列、5mC甲基化與染色質(zhì)可及性，支持核小體定位、TF足跡、單倍型染色質(zhì)構(gòu)象與共激活分析。

實(shí)驗(yàn)流程

將分離出的細(xì)胞核用N6 - 腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（6mA-MTase）對(duì)細(xì)胞核內(nèi)裸露 DNA 進(jìn)行標(biāo)記，開(kāi)放區(qū)域優(yōu)先被修飾，核小體 / 蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)因不可及而保持未修飾。經(jīng)過(guò)標(biāo)記步驟后，終止反應(yīng)，提取高保真長(zhǎng)片段 DNA并進(jìn)行文庫(kù)制備，隨后應(yīng)用Pacific Biosciences HiFi 測(cè)序平臺(tái)，通過(guò)直接或原生DNA（amplification-free，無(wú)需核酸擴(kuò)增）測(cè)序方案進(jìn)行測(cè)序。將可及位點(diǎn)（6mA峰）映射到單分子序列上，從而推斷染色質(zhì)開(kāi)放與核小體位置。Fiber-seq 檢測(cè)技術(shù)可用于單倍型定相染色質(zhì)可及性圖譜繪制，以及內(nèi)源性CpG DNA 甲基化（DNAme）譜分析。

Fiber-seq實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備注意事項(xiàng)
（以使用EpiCypher CUTANA™ Hia5 for Fiber-seq 甲基轉(zhuǎn)移酶體系為例）

• 起始樣本投入

  - 新鮮分離、未固定的細(xì)胞核。
  - 參考人的基因組大小，需要準(zhǔn)備約1百萬(wàn)的細(xì)胞核，考慮到細(xì)胞核分離過(guò)程有損失，需要準(zhǔn)備至少2百萬(wàn)的高活性的細(xì)胞（建議細(xì)胞活率大于80%）。如果研究的是其他物種，如基因組較小的物種，建議投入更大量的細(xì)胞核，才能匹配1百萬(wàn)個(gè)人類(lèi)細(xì)胞核的總DNA含量，這樣做可以確保標(biāo)記的一致性，并為長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序提供足夠的 DNA。（例如小鼠基因組2.7G，其大小約為人類(lèi)基因組的84%，建議細(xì)胞核投入量120萬(wàn)）

• 文庫(kù)測(cè)序建議

  人類(lèi)基因組樣本建議每個(gè)樣本測(cè)90 G，約30 x的基因組覆蓋度。檢測(cè) 6mA 和內(nèi)源性 DNA 甲基化（5mC）需要采用原生或直接長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)。Fiber-seq 技術(shù)與短讀長(zhǎng)測(cè)序流程不兼容，因?yàn)榧谆�化�?biāo)記會(huì)在 PCR 擴(kuò)增過(guò)程中丟失。如果需要單倍型定相數(shù)據(jù)，則需要樣本測(cè)序達(dá)到每個(gè)單倍型 30× 覆蓋度（即二倍體細(xì)胞類(lèi)型需達(dá)到 60× 覆蓋度）。

相較于做染色質(zhì)可及性分析的另一種技術(shù)ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing，即利用轉(zhuǎn)座酶研究染色質(zhì)可及性的高通量測(cè)序技術(shù)），F(xiàn)iber-seq 在同一套長(zhǎng)讀數(shù)據(jù)中可獲得 ATAC-seq 無(wú)法提供的多類(lèi)信息，包括一次測(cè)序同時(shí)讀出序列、6mA（可及性）與 5mC。

Fiber-seq以 6mA-MTase 標(biāo)記開(kāi)放區(qū)，可以避免Tn5 轉(zhuǎn)座酶的酶切偏好與 PCR 偏差，長(zhǎng)讀長(zhǎng)覆蓋 SNP/Indel 并與表觀信號(hào)聯(lián)合，可完成單倍型特異性染色質(zhì)分析。

下表從多個(gè)維度上對(duì)比了這兩種測(cè)序技術(shù)。

Fiber-seq作為一項(xiàng)突破性技術(shù)，可以從單個(gè)DNA長(zhǎng)分子上同步讀取多重信息，其中PacBio公司的HiFi測(cè)序是 Fiber-seq的技術(shù)基礎(chǔ)和實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量數(shù)據(jù)的保障，可以說(shuō) Fiber-seq 是“站在HiFi的肩膀上”，將HiFi的長(zhǎng)讀長(zhǎng)和高精度優(yōu)勢(shì)發(fā)揮到了極致，解鎖了在單分子水平上同步解讀基因組、表觀基因組和三維基因組的全新能力。

北京怡美通德科技發(fā)展有限公司是PacBio的官方授權(quán)代理商，代理美國(guó)PacBio公司生產(chǎn)的Vega桌面式三代測(cè)序系統(tǒng)，提供儀器配套的試劑耗材供貨、產(chǎn)品演示實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)品安裝、使用培訓(xùn)以及售前售后技術(shù)咨詢(xún)、生物信息學(xué)分析等相關(guān)技術(shù)服務(wù)。

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