單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組長讀長測序揭示癌癥研究中難以獲得的重要見解

癌癥研究中，在異構(gòu)體水平上對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行特征分析的能力至關(guān)重要。常規(guī)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)中，短讀長序列僅能捕獲基因水平的信息。

Iso-Seq® 技術(shù)（Isoform Sequencing，PacBio® HiFi 測序的全長 RNA 測序技術(shù)）已被證實(shí)可推動癌癥研究，該技術(shù)能在單細(xì)胞水平上對異構(gòu)體進(jìn)行明確的特征分析，而其他長讀長技術(shù)則缺乏識別獨(dú)特分子標(biāo)識符（UMI）和細(xì)胞條形碼（CBC）所需的準(zhǔn)確性。PacBio Kinnex™ RNA 試劑盒以 MAS-Seq 技術(shù)為基礎(chǔ)（該技術(shù)可將 cDNA 等擴(kuò)增子連接成更長的片段），進(jìn)一步提升了 HiFi 長讀長測序儀的測序通量。對連接分子進(jìn)行測序所產(chǎn)生的 HiFi 讀長序列，可通過生物信息學(xué)方法拆分，從而獲取原始的 cDNA 序列。

本文重點(diǎn)介紹幾篇將 Iso-Seq 技術(shù)應(yīng)用于癌癥研究的文獻(xiàn)，闡釋單細(xì)胞 Iso-Seq 數(shù)據(jù)如何用于檢測融合基因、識別可能作為疫苗候選新表位的新型異構(gòu)體，以及追溯克隆進(jìn)化過程。

檢測融合基因

短讀長測序可輕松識別融合連接點(diǎn)，但由于讀長不足，無法完整解析單個融合轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)。Dondi et al.（2023）將 Kinnex 連接法的早期版本應(yīng)用于卵巢癌樣本的單細(xì)胞全長 RNA 測序中。在他們的 Kinnex 測序數(shù)據(jù)中，鑒定出了一種患者特異性的 IGFBP2::TESPA1 融合基因；而在匹配的短讀長測序數(shù)據(jù)中，該融合基因此前被誤判為 TESPA1 基因高表達(dá)，因為短讀長測序僅捕獲到了該融合基因的 3' 端融合部分，即 TESPA1 基因部分。
 

圖1. 對新鮮處理的高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶，以及與患者匹配的無腫瘤遠(yuǎn)端大網(wǎng)膜組織活檢樣本進(jìn)行的單細(xì)胞 RNA 短讀長及長讀長測序。

圖2. 長讀長單細(xì)胞 RNA 測序鑒定出腫瘤特異性融合基因 IGF2BP2::TESPA1，而短讀長數(shù)據(jù)將該基因誤判為 TESPA1 過表達(dá)。

腫瘤新抗原發(fā)現(xiàn) - 新型異構(gòu)體發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用

剪接失調(diào)（splicing dysregulation）是大多數(shù)癌癥中普遍存在的特征，但人們對異常剪接的整體情況仍知之甚少。Li et al.（2024）的研究中，研究人員通過單細(xì)胞 RNA 測序技術(shù)研究結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC），在腫瘤上皮細(xì)胞中鑒定出 394 種失調(diào)的轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)。該研究同時發(fā)現(xiàn)了腫瘤特異性及異構(gòu)體特異性的 RNA 編輯事件，通過質(zhì)譜驗證篩選出具有腫瘤特異性的新型異構(gòu)體。研究人員開發(fā)了一種算法，依據(jù)人類白細(xì)胞抗原（HLA）結(jié)合親和力對這些潛在的新抗原進(jìn)行排序。借助這一方法，他們發(fā)現(xiàn)了 4 種新型腫瘤特異性異構(gòu)體，這些異構(gòu)體對廣大結(jié)直腸癌患者群體均具有較強(qiáng)的 HLA 結(jié)合親和力，有望成為癌癥疫苗的候選分子。

圖3. 工作流程示意圖：12 例結(jié)直腸癌（CRC）患者腫瘤樣本與正常樣本的長讀長（PacBio）及短讀長（Illumina）單細(xì)胞 RNA 測序（scRNA-seq）。

圖4. 上圖為用于癌癥疫苗研發(fā)的、基于新型腫瘤特異性反復(fù)出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體的新表位鑒定流程；下圖展示22 個新表位針對 TCGA-COAD 患者 HLA 等位基因的親和力及排序。

追蹤克隆進(jìn)化

常規(guī)短讀長單細(xì)胞 RNA 測序（short-read single-cell RNA-Seq）僅能覆蓋轉(zhuǎn)錄本的 5' 端或 3' 端，因此在基于腫瘤體細(xì)胞突變確定細(xì)胞基因型的能力上存在局限。相比之下，單細(xì)胞 Iso-Seq 技術(shù)能夠?qū)�來自多個單細(xì)胞平臺的全長 cDNA 進(jìn)行測序。

Black et al.（2024）將PacBio Kinnex單細(xì)胞RNA試劑盒應(yīng)用于由 10x Genomics Chromium平臺生成的單細(xì)胞 cDNA 中，該cDNA來源于攜帶BTK耐藥突變的慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）樣本，研究表明應(yīng)用長讀長測序結(jié)果在基因分型能力方面有顯著提升。對于在≥1% 的細(xì)胞中存在的變異位點(diǎn)，Illumina短讀長測序僅覆蓋了其中的7.61%，而Kinnex數(shù)據(jù)則覆蓋了18.59%的此類變異位點(diǎn)。這一結(jié)果進(jìn)而幫助優(yōu)化了其中一個樣本的亞克隆結(jié)構(gòu)，清晰呈現(xiàn)出兩個不同的突變亞克隆 —— 這兩個亞克隆此前被錯誤地識別為單一亞克隆。

圖5. A) 從批量 DNA 測序數(shù)據(jù)中識別出的亞克隆結(jié)構(gòu)。慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）相關(guān)基因突變會標(biāo)注在其所在的亞克隆下方。B) 患復(fù)發(fā)樣本的基因型矩陣圖有助于完善原始亞克隆結(jié)構(gòu)。綠色表示在該細(xì)胞內(nèi)特定變異位點(diǎn)的scRNA-seq中僅存在參考等位基因；紅色表示該細(xì)胞內(nèi)至少有一個scRNA-seq測序讀數(shù)包含體細(xì)胞變異等位基因。顏色越深，表明支持該基因型的reads數(shù)量越多。為提高區(qū)分亞克隆的分辨率，僅納入了CLL相關(guān)基因突變。C) 經(jīng)完善的亞克隆結(jié)構(gòu)顯示，包含BTK基因 c.1543T>A突變的亞克隆，與包含BTK基因c.1544G>C 突變和DICER1基因突變的亞克隆相互獨(dú)立。

Wedemeyer et al.（2024）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用Kinnex單細(xì)胞RNA試劑盒對一株攜帶已知單核苷酸變異（PIK3CA:c.3139C>T）的患者來源成纖維細(xì)胞進(jìn)行測序時，長讀長測序在15.3%的細(xì)胞中覆蓋了該變異位點(diǎn)；相比之下，使用Illumina短讀長測序時，僅在1.2%的細(xì)胞中覆蓋了該變異位點(diǎn)。此外，通過將突變型細(xì)胞與野生型細(xì)胞進(jìn)行對比，研究人員發(fā)現(xiàn)了通常與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)的獨(dú)特基因表達(dá)模式及信號通路，這一發(fā)現(xiàn)為理解為何僅存在于少量細(xì)胞群體中的變異，能導(dǎo)致巨腦-毛細(xì)血管畸形綜合征（MCAP）患者出現(xiàn)顯著臨床表型提供了思路。

圖6. 上圖Chord diagram顯示，在野生型 PIK3CA（PIK3CAwt）成纖維細(xì)胞與未分化角質(zhì)形成細(xì)胞之間存在Notch介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，而在突變型PIK3CA（PIK3CAmut）成纖維細(xì)胞與未分化角質(zhì)形成細(xì)胞之間則無此信號傳導(dǎo)。下圖展示野生和突變型細(xì)胞富集前10的Gene Ontology BP點(diǎn)圖。

小結(jié)

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組長讀長測序（Iso-Seq 技術(shù)），能夠揭示癌癥研究中難以通過短讀長測序獲得的重要見解。單細(xì)胞 Iso-Seq技術(shù)還可結(jié)合 Kinnex 試劑盒應(yīng)用，提高測序通量，用于檢測新型異構(gòu)體、融合轉(zhuǎn)錄本和新抗原，同時對單細(xì)胞進(jìn)行基因分型并追蹤克隆群體，最終獲得對癌癥轉(zhuǎn)錄組更全面的認(rèn)識。
 

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參考文章：

1.Black et al. (2024). Long-read single-cell RNA sequencing enables the study of cancer subclone specific genotype and phenotype in chronic lymphocytic leukemia. BioRxiv. https://doi.org/10.1101/2024.03.15.585298

2.Dondi, A., Lischetti, U., et al. (2023). Detection of isoforms and genomic alterations by high-throughput full-length single-cell RNA sequencing in ovarian cancer. Nature Communications, 14(1), 7780. https://doi.org/10.1038/s41467-023-43387-9

3.Li, Z., Zhang, B., Chan, J. J., et al. (2024). An isoform resolution transcriptomic atlas of colorectal cancer from long-read single-cell sequencing. Cell Genomics, 4(9). https://doi.org/10.1016/j.xgen.2024.100641

4.Wedemeyer, M. A., et al. (2024). Defining the transcriptome of PIK3CA-altered cells in a human capillary malformation using single cell long-read sequencing. Scientific Reports, 14(1), 25440. https://doi.org/10.1038/s41598-024-72167-8