PacBio Kinnex單細胞全長轉錄組測序技術原理、流程及其應用案例

在生命科學的微觀世界里，單細胞測序技術讓我們得以傾聽每一個細胞的“低語”。 然而，傳統(tǒng)的短讀長測序就像“盲人摸象”， 通過零碎的片段推測整體，只能得到基因表達的輪廓，無法描繪出轉錄本異構體千變?nèi)f化的全貌。而這些被忽略的異構體信息，卻往往包含理解細胞類型、狀態(tài)和功能差異的關鍵。現(xiàn)在，PacBio Kinnex 單細胞全長轉錄組解決方案帶來了革命性的突破，它使單細胞測序不再局限于“摸到象腿或象鼻”，以HiFi長讀長、高精度和高通量的優(yōu)勢，直接對單個細胞中全長RNA分子進行完整測序，涵蓋所有曾經(jīng)被短讀長“錯過”的轉錄異構體細節(jié)，同時精準捕獲細胞Barcode和UMI信息，使研究人員真正告別“盲人摸象”的時代，能夠站在單個細胞的維度看清哪些特定異構體被表達，從而解讀出每個細胞內(nèi)部更豐富、更精確的“完整故事”，為癌癥腫瘤免疫和神經(jīng)科學等領域帶來前所未有的洞察。

01  Kinnex single-cell RNA產(chǎn)品優(yōu)勢

長讀長
長讀長可直接獲得從5'至3'端的全長轉錄本信息，便于檢測到新基因和轉錄異構體。

高準確性
HiFi測序的準確率可達99.9%（Q30），準確檢測到細胞Barcode和UMI信息的同時能夠精確表征可變剪接位點、解析融合基因信息以及區(qū)分細胞亞型。

高通量
Kinnex單細胞全長轉錄組建庫方案使用16x cDNA串聯(lián)方式進行文庫構建，大幅提升了全長轉錄組的測序通量，降低了建庫測序的成本。

02  Kinnex單細胞全長轉錄組技術原理與流程

Kinnex 單細胞全長RNA試劑盒采用MAS-Seq方法來提高PacBio長讀長測序的通量。MAS-Seq 是一種將cDNA分子連接成較長片段的串聯(lián)方法。對串聯(lián)分子測序產(chǎn)生的 HiFi reads 進行生物信息學拆分，即可檢索到原始cDNA序列。Kinnex單細胞全長轉錄組建庫流程以單細胞cDNA作為起始樣本，支持從10x Chromium Single Cell 3' Kit（v3.1, v4）和Single Cell 5' Kit（v2, v3）生成的cDNA，作為Kinnex single-cell RNA試劑盒的輸入樣本，以16x cDNA串聯(lián)方式連接形成有序陣列，并在兩側添加接頭進行文庫構建，從而提高通量，減少測序成本，實現(xiàn)經(jīng)濟高效的單細胞全長轉錄組測序。此外，Kinnex單細胞全長轉錄組建庫過程中也可加入文庫Barcode標簽信息，支持多樣本混樣測序，增加了不同數(shù)據(jù)量實驗需求的靈活性。
 
03  Kinnex single-cell RNA數(shù)據(jù)表現(xiàn)

上表為使用10x Chromium GEM-X Single Cell 5' 和 3' 試劑盒生成的PBMC cDNA通過Kinnex single-cell RNA試劑盒建成的單細胞文庫在PacBio的Revio和Vega長讀長平臺測序并使用SMRT Link中的Read Segmentation和Single-Cell Iso-Seq工作流程進行分析后得到的測試數(shù)據(jù)，結果表明，Kinnex數(shù)據(jù)具有高效的數(shù)據(jù)產(chǎn)出和良好的穩(wěn)定性。通常情況下，在Vega和Revio系統(tǒng)上的單張SMRT Cell產(chǎn)出的HiFi reads經(jīng)生信拆分還原后預計分別獲得50-60M和100-120M reads的轉錄本數(shù)據(jù)產(chǎn)出。

左圖為進一步使用三級生信工具CellTypist處理Revio測序得到的PBMC 10x 5' 單細胞SMRT Link輸出結果的細胞聚類UMAP圖，鑒定了PBMC數(shù)據(jù)集中含有的不同細胞類型。右圖為同時構建HG002樣本的10x 5' 單細胞Kinnex和Illumina文庫后測序結果比對的Pearson相關性展示圖，Pearson相關性系數(shù)為0.992，由此可見兩者細胞UMI計數(shù)的高度一致性。

 
04  Kinnex single-cell RNA應用案例解析

案例1

題目：Detection of isoforms and genomic alterations by high-throughput full-length single-cell RNA sequencing in ovarian cancer
研究領域：腫瘤學（卵巢癌）

主要結果：

圖1 研究設計概覽和長讀長測序數(shù)據(jù)轉錄異構體分析
 

圖2 細胞注釋聚類和細胞類型特異性轉錄本異構體分布
 

圖3 腫瘤和患者特異性融合基因 IGF2BP2::TESPA1 檢測

 
了解癌癥的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性及其與腫瘤微環(huán)境（TME）的復雜相互作用需要單細胞分辨率的基因型和表型信息。在瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學院研究團隊的一項研究中，研究者采用10x Genomics平臺進行單細胞捕獲，結合串聯(lián)的實驗策略對網(wǎng)膜轉移的卵巢癌患者的腫瘤和癌旁配對樣本進行了基于PacBio全長的單細胞轉錄組測序，共檢測到152,000個轉錄異構體，其中超過52,000個是新發(fā)現(xiàn)的轉錄異構體。該研究中，研究人員同時進行了長讀長和短讀長測序，發(fā)現(xiàn)兩者單獨鑒定的細胞類型和種類占比都非常相似，并表明通過PacBio的全長單細胞轉錄組測序可檢測到細胞類型特異性轉錄異構體，揭示了腫瘤和間皮細胞中的差異異構體表達，還發(fā)現(xiàn)間皮細胞在轉移中部分通過TGF-β/miR-29/膠原軸轉變?yōu)榘┌Y相關成纖維細胞。此外，研究人員通過單細胞全長轉錄組準確識別了融合基因，包括一種新的經(jīng)過scDNA測序驗證的IGF2BP2::TESPA1融合，該融合在匹配的二代短讀長測序中不僅沒有發(fā)現(xiàn)，且被錯誤歸類為TESPA1基因高表達。這是由于二代測序讀長較短，無法跨越和覆蓋基因的融合位點，僅捕獲到了該融合基因的 3' 端融合部分，即 TESPA1 基因部分，從而導致錯誤的分析結果。

案例2

題目：Developmental isoform diversity in the human neocortex informs neuropsychiatric risk mechanisms
研究領域：神經(jīng)發(fā)育與疾病

主要結果：

圖1 妊娠中期發(fā)育中人類大腦新皮層的細胞類型特異性的全長轉錄組實驗設計，轉錄異構體多樣性的表征與細胞聚類和差異表達異構體分析
 

圖2 以異構體為中心的神經(jīng)遺傳風險機制解析，AKT3轉錄異構體受DNM影響的表征
 

PacBio Kinnex 單細胞全長轉錄組建庫流程需要使用Kinnex single-cell RNA kit (103-072-200)，前期單細胞cDNA樣本制備支持搭配10x Genomics的Chromium Single Cell 3' GEM Kit（v3.1, v4）和Single Cell 5' GEM Kit（v2, v3）使用。

近年來，隨著單細胞測序的深入研究，基于PacBio的單細胞全長轉錄組測序已在各大頂刊中嶄露頭角，以其在可變剪接、基因融合和突變檢測的覆蓋范圍及測序準確性方面的巨大優(yōu)勢，為精準腫瘤學、癌癥疫苗藥物預測和神經(jīng)發(fā)育與疾病等領域的復雜生物學問題解析帶來了新的進展，Kinnex方法帶來的高通量提升，也將使單細胞技術領域的發(fā)展推向新的高度。

 
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參考文獻
1. Dondi A, Lischetti U, Jacob F, Singer F, Borgsmüller N, Coelho R; Tumor Profiler Consortium; Heinzelmann-Schwarz V, Beisel C, Beerenwinkel N. Detection of isoforms and genomic alterations by high-throughput full-length single-cell RNA sequencing in ovarian cancer. Nat Commun. 2023 Nov 27;14(1):7780. doi: 10.1038/s41467-023-43387-9. PMID: 38012143; PMCID: PMC10682465.
2. Patowary A, Zhang P, Jops C, Vuong CK, Ge X, Hou K, Kim M, Gong N, Margolis M, Vo D, Wang X, Liu C, Pasaniuc B, Li JJ, Gandal MJ, de la Torre-Ubieta L. Developmental isoform diversity in the human neocortex informs neuropsychiatric risk mechanisms. Science. 2024 May 24;384(6698):eadh7688. doi: 10.1126/science.adh7688. Epub 2024 May 24. PMID: 38781356; PMCID: PMC11960787.