10x GEM-X試劑單細胞CRISPR篩選實驗方案流程及應(yīng)用

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是細菌和古菌所使用的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其通過記錄和靶向病毒的 DNA 序列來抵御入侵的病毒。這一機制已被重新改造為一種簡單、可靠且用途廣泛的技術(shù)，用于哺乳動物及其他生物的基因組編輯，使研究人員能夠?qū)Ω黝惿�物學過程和疾病狀態(tài)進行研究。

CRISPR篩選是功能基因組學研究人員不可或缺的工具，但傳統(tǒng)篩選方法既復(fù)雜又耗時，而且數(shù)據(jù)輸出的分辨率低。傳統(tǒng)篩選實驗使用Bulk RNA 輸入來評估所有細胞的平均基因表達水平，從而掩蓋了細胞異質(zhì)性；與之不同的是，單細胞 CRISPR 篩選技術(shù)能在單細胞水平上，評估整個轉(zhuǎn)錄組中多個基因以及每個單獨 sgRNA 的擾動效應(yīng)。（圖1）

圖1

如果說傳統(tǒng)CRISPR是一把分子剪刀，那么單細胞CRISPR可謂是一把多功能的瑞士軍刀，可快準狠的破解生物的多重奧秘。

來自單細胞分析引領(lǐng)品牌10x Genomics的Chromium單細胞CRISPR篩選技術(shù)帶來了一個更簡單、更快速的工作流程，采用Feature Barcode技術(shù)和新一代測序技術(shù)來檢測單鏈向?qū)�RNA（sgRNA），該技術(shù)可評估慢病毒向?qū)?RNA（sgRNA）轉(zhuǎn)導(dǎo)的單細胞輸入，提供了一種高通量、可擴展的方法，能在同一個單細胞中同時獲取基因表達譜和 CRISPR 介導(dǎo)的擾動表型。（圖2）

圖2  * 包括擾動或施加刺激后的培養(yǎng)時間

10x Genomics最新版GEM-X試劑提供了兩種單細胞CRISPR篩選實驗方案：應(yīng)用于新鮮樣本的GEM-X 5’ CRISPR Screening，以及應(yīng)用于固定后樣本的GEM-X Flex CRISPR Screening。這兩款產(chǎn)品均能將單細胞基因表達分析與CRISPR篩選相結(jié)合，以單細胞分辨率將CRISPR擾動與完整的基因表達表型直接關(guān)聯(lián)。

GEM-X 5’ CRISPR Screening

采用 Feature Barcode 技術(shù)進行 CRISPR 篩選的 Chromium 單細胞免疫組庫分析（也稱為單細胞 5' 端 CRISPR 篩選）提供了一種多組學研究方法，可從同一個單細胞中同時檢測基因表達、CRISPR 向?qū)Х肿印⒓毎�表面蛋白�?/ 或免疫細胞克隆型頻率。這種單細胞 5' 端 CRISPR 篩選方法與大多數(shù) Cas9 CRISPR 載體兼容，且無需在向?qū)?RNA（sgRNA）中整合特定捕獲序列。

10x Genomics建議每個靶向向?qū)?RNA（sgRNA）使用100-200個細胞，這能確保有足夠的統(tǒng)計檢驗力來判斷擾動的顯著性。對于非靶向向?qū)?RNA（sgRNA），其對于提供計算擾動所需的基線至關(guān)重要，建議使用 5-10% 的非靶向sgRNA。Chromium 單細胞 CRISPR 篩選檢測試劑盒Chromium GEM-X 5’ 芯片的每個通道上可回收多至 20,000個細胞，其中1,000-2,000個（5%-10%）細胞為含非靶向向?qū)?RNA（sgRNA）的細胞。每個靶向向?qū)?RNA（sgRNA）應(yīng)對應(yīng) 100-200 個細胞。采用這種設(shè)置，使用GEM-X 5’ 芯片的單個通道即可檢測約 90-180 個向?qū)?RNA（sgRNA）。如果您希望檢測更多種sgRNA，可加大細胞量，上滿芯片所有8個通道且回收160,000 個細胞，便可進行Pooled CRISPR篩選，檢測約1000個sgRNA。

【實驗流程】

1. 確認sgRNA兼容性

為兼容 Chromium 單細胞 5' 端 CRISPR 篩選檢測試劑盒，向?qū)?RNA（sgRNA）需經(jīng)工程改造以適配標準 Cas9 系統(tǒng)，圖3 顯示了5’ CRISPR 反轉(zhuǎn)錄引物的結(jié)合區(qū)域。

圖3

CRISPR 逆轉(zhuǎn)錄（RT）引物設(shè)計于向?qū)?RNA（sgRNA）骨架的高度保守區(qū)域，以實現(xiàn)對各類Cas9系統(tǒng)的高兼容性。該序列（5’-CAAGTTGATAACGGACTAGCC-3’）與向?qū)?RNA 骨架序列互補。在進行單細胞CRISPR實驗前，建議將CRISPR 引物序列的反向互補序列，與目標 sgRNA 向?qū)�文庫進行 BLAST 比對，以確認兼容性。上述引物序列的反向互補序列為：5'-GGCTAGTCCGTTATCAACTTG-3'。若向?qū)?RNA 骨架不含上述序列，可設(shè)計定制化富集引物來擴增特殊向?qū)?RNA。

2.sgRNA捕獲及文庫構(gòu)建

將帶有條形碼的單細胞 5'凝膠珠、含有轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的 Master Mix（混合反應(yīng)液）以油（Partitioning Oil）GEM-X 5’ 芯片上混合，即可生成 GEMs（油包水微滴）。GEMs 生成后，凝膠珠立即溶解，油包水內(nèi)細胞隨之裂解。凝膠珠釋放出寡核苷酸，與細胞裂解物以及含有逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑和引物混合物的 Master Mix 混合。通過孵育 GEMs，可同時從細胞mRNA 中生成帶有 10x 條形碼的全長 cDNA，并從 sgRNA中生成帶有條形碼的 DNA，進而可從這些帶有 10x 條形碼的 cDNA 中構(gòu)建出可用于測序的基因表達文庫和 CRISPR 篩選文庫（圖4）。

圖4

3.文庫測序及數(shù)據(jù)分析

在確定特定擾動的效應(yīng)時，目標基因表達的動態(tài)測序深度范圍是關(guān)鍵因素。由于特定基因的 UM數(shù)量取決于基因表達文庫的整體測序深度，文庫的測序深度越深，可檢測到的 UMI 就越多（直至基因表達文庫達到飽和狀態(tài)，此時每增加一次新的測序讀數(shù)，檢測到新 UMI 的可能性極低）。特定基因檢測到的 UMI 數(shù)量越多，其表達變化被檢測到且具有顯著性的可能性就越大。下圖（圖5）建議了5’表達譜、5’ CRISPR等文庫的最低測序量。

圖5

使用10x Genomics數(shù)據(jù)分析軟件Cell Ranger 9.0.0版本分析每個反應(yīng)通道的數(shù)據(jù)，如實驗中大量細胞上樣到多個反應(yīng)通道，可使用cellranger aggr流程將生成的多個輸出結(jié)果匯總在一起。

GEM-X Flex CRISPR Screening

10x Genomics Chromium GEM-X Flex基因表達分析技術(shù)為固定樣本中的基因表達檢測提供了全面且可擴展的解決方案。在該檢測中，10x Genomics公司提供了預(yù)先設(shè)計的人和小鼠的全轉(zhuǎn)錄組探針panel，用于目標基因雜交。您可根據(jù)本文件中的指導(dǎo)設(shè)計定制化探針，添加到商品化的探針試劑盒中，用于在檢測基因表達的同時檢測CRISPR 篩選。

1. CRISPR Guide Probe設(shè)計合成及使用說明

用于 GEM-X Flex 基因表達分析的 CRISPR 向?qū)�探針設(shè)計請見圖6概述，探針設(shè)計的序列詳見表1，所使用的 CRISPR LHS 探針 barcode 序列（CR001-CR016）列于表 2 中。

圖6

表1

要設(shè)計用于GEM-X Flex檢測的CRISPR向?qū)Р东@定制探針，必須預(yù)先知曉向?qū)Ч羌埽╣uide scaffold）和間隔序列（spacer sequences），探針設(shè)計參考以下原則：
 · 左側(cè)探針（LHS Probe）包含TruSeq R2、探針條形碼（Probe Barcode）以及一段25 bp的向?qū)Ч羌芑パa序列。TruSeq 接頭可添加CRISPR文庫的Index。
· CRISPR左側(cè)探針條形碼（LHS Probe Barcode）序列與全轉(zhuǎn)錄組分析（WTA）探針中使用的序列不同，詳見表 2。
· 右側(cè)探針（RHS Probe）包含 5’磷酸基團（/5Phos/）、一段 5 bp 的向?qū)Ч羌芑パa序列、一段20 bp的靶向間隔序列互補序列，以及部分Capture Sequence 1（pCS1）。

在多樣本混樣實驗中，每個左側(cè)探針（LHS Probe）必須帶有唯一的 8 堿基探針條形碼（CR001-CR016；序列詳見表 2），且每個雜交反應(yīng)的 CRISPR 探針和全轉(zhuǎn)錄組擴增（WTA）探針均需使用唯一的探針條形碼對，即同一 CRISPR 探針條形碼不得與多個 WTA 探針條形碼搭配使用。在單重實驗中，可省略該探針條形碼。

定制探針可從任何寡核苷酸合成供應(yīng)商處訂購。10x Genomics已在IDT提供的多種形式定制探針中進行了測試，包括DNA寡核苷酸（標準脫鹽）、Ultramer DNA 寡核苷酸和 oPool 寡核苷酸庫。在有限的測試中，所有形式均觀察到了可比較的結(jié)果。

合成探針關(guān)鍵指導(dǎo)原則如下：
· 探針應(yīng)經(jīng)過標準脫鹽處理。
· 無需進行 HPLC 純化。
· 探針應(yīng)重懸于 IDTE（或低 EDTA TE 緩沖液）中。
· 右側(cè)（RHS）探針必須進行 5' 磷酸化。
· 帶條形碼的左側(cè)（LHS）探針應(yīng)單獨訂購，采用標準脫鹽形式。
· 右側(cè)（RHS）探針可單獨以標準脫鹽形式訂購，也可作為 oPool 寡核苷酸庫訂購。

使用CRISPR Guide Probe，需首先制備一個混合的 spike-in 庫，其中包含終濃度為 40 nM 的各右側(cè)（RHS）探針，以及終濃度為400 nM的帶條形碼的CRISPR 左側(cè)（LHS）探針。在向重懸的細胞沉淀中加入10x Genomics的人/小鼠全轉(zhuǎn)錄組擴增（WTA）探針后，再向樣本中加入2.5 μl該spike-in庫。

每個靶向sgRNA建議上樣100–200個細胞，以確保有足夠的統(tǒng)計效力來確定擾動的顯著性。對于非靶向 sgRNA（其對提供計算擾動的基線至關(guān)重要），建議上樣500–1000個細胞。當使用全部16種探針進行多重檢測時，使用GEM-X Flex檢測可從每個反應(yīng)可回收多達320,000個細胞。當使用芯片的全部8個孔（目標回收率約為2.5×10⁶個細胞）時，可檢測的sgRNA總數(shù)（包括非靶向 sgRNA）為12,000–25,000個。

2.實驗流程及需要準備的額外試劑

GEM-X Flex基因表達和CRIPSR檢測的實驗流程如下圖（圖7）

使用GEM-X Flex檢測試劑盒進行CRISPR篩選時，除GEM-X Flex試劑盒外，還需要以下額外的10x Genomics試劑：
・Dual Index Kit TT Set A 96 rxns, PN-1000215
・Amp Mix，可從GEM-X Single Cell 5' Feature Barcode Kit （PN-1000703）中獲取。
・用戶自備的 TruSeq 引物，引物應(yīng)訂購標準脫鹽級別的產(chǎn)品。

- 正向引物（TruSeq Read 1）：CTACACGACGCTCTTCCGATCT
- 反向引物（TruSeq Read 2）：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG

為進行 CRISPR 篩選，需要在原User Guide（CG000789）基礎(chǔ)上對以下步驟進行修改或新增，具體操作請參考10x Technical Note CG000814：
Step 1: Probe Hybridization (Modified)
Step 4: Pre-Amplification PCR (Modified)
New Step: Feature PCR
New Step: CRISPR Screening Library Construction 

3.文庫測序及數(shù)據(jù)分析

建議將GEM-X Flex CRISPR 篩選文庫與基因表達文庫混合二者混合，以在測序過程中維持核苷酸多樣性。GEM-X Flex 基因表達文庫的建議最低測序深度為 10,000 read Pairs / 細胞，GEM-X Flex CRISPR 篩選文庫的建議最低測序深度為 5,000 read pairs / 細胞。圖8和圖9 分別展示了兩文庫結(jié)構(gòu)及測序讀長建議。

圖8

圖9

10x Genomics數(shù)據(jù)分析軟件Cell Ranger支持對單重和多重 Flex+CRISPR 數(shù)據(jù)的分析。在分析多重實驗時，Multi Config CSV 文件需要同時指定 WTA（全轉(zhuǎn)錄組擴增）和 CRISPR 的探針條形碼，詳情請參見 10x Genomics 支持網(wǎng)站（Flex Gene Expression & Feature Barcode Analysis with Cell Ranger multi (Singleplex & Multiplex) | 10x Genomics）。與目前市場上的 CRISPR 工作流程類似，需要使用特征參考文件（feature reference file）來識別不同的前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer）。請參照 “5' CRISPR 向?qū)Р东@” 的特征參考示例進行操作（Cell Ranger Feature Reference CSV | 10x Genomics）。
 

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