Pipetty電動移液器在豬藍耳病毒檢測（間接Elisa）中的應用

方案摘要：豬繁殖與呼吸綜合征，是由病毒（PRRSV）感染豬引起的一種高度傳染性疫病，臨床表現為母豬繁殖系統障礙，斷奶仔豬消瘦、生長遲緩以及死亡率增加。該病能引起豬體溫升高、呼吸困難，導致豬耳朵發紺，又稱藍耳病，間接 ELISA 檢測是臨床和實驗室中常用的血清學檢測方法，核心目的是通過檢測豬血清 / 血漿中的 PRRSV 特異性抗體，判斷豬只是否感染過 PRRSV 或接種疫苗后是否產生免疫應答。使用Pipetty電動移液器連續多次分液功能，可以大幅縮短加樣時間，降低人為引起的精度誤差，減少使用者的手部疲勞，有效提升了檢測效率。
 
方案詳情：
一、實驗原理
      該方法通過檢測豬血清中 PRRSV 特異性抗體，判斷感染或疫苗免疫情況，核心為 “固相抗原捕獲 + 酶標二抗信號放大”：先將 PRRSV 特異性抗原（需匹配美洲型 / 歐洲型）包被酶標板并封閉，加入待檢樣本后，若含目標抗體則與抗原結合，洗去游離成分；再加入酶標抗豬 IgG 二抗，結合形成“抗原 - 抗體 - 酶標二抗”復合物，洗板后加底物顯色。通過酶標儀讀 OD 值，結合陰陽性對照定臨界值判讀結果。需注意：無法區分自然感染與疫苗免疫，感染后 7-14 天內抗體未產生可能漏檢。
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② 96孔平底聚苯乙烯酶標反應板；
③ 酶聯免疫測定儀；
④ 37 ℃恒溫箱。
 
2、試劑和材料
① PRRSV 抗原：提純的 PRRSV 重組 N蛋白抗原（PRRSV-1或 PRRSV-2或其混合抗原）；
② PRRSV 陽性血清、陰性血清、HRP-免抗豬IgG結合物。使用前用稀釋液稀釋至工作濃度；
③ 洗滌液、血清稀釋液、顯色/底物溶液（TMB-H₂0₂）、抗原稀釋液、封閉液等（也可使用商品化的檢測 PRRSV N蛋白抗體的試劑盒）。
 
三、實驗步驟
1、用抗原稀釋液將 PRRSV抗原稀釋成工作濃度，使用Pipetty電動移液器，設置連續分液模式，每孔 100 μL，加入 96 孔反應板中，封板后置濕盒內 37 ℃恒溫箱中 60 min，然后放入4℃冰箱過夜。
 
2、棄去板中稀釋液，加洗滌液洗板，300μL/孔，洗滌3次，每次1min，在吸水紙上輕輕拍干。
3、加入封閉液，200μL/孔，封板后置濕盒內 37 ℃恒溫箱中反應 60 min。
4、用步驟2的方式，再一次進行洗滌。
5、取5 μL血清樣本，加入195μL血清稀釋液，自動混勻，進行1：40稀釋。在 PRRSV 抗原包被反應板中加入稀釋的被檢血清、陽性血清對照和陰性血清對照，每孔100μL。陽性血清對照和陰性血清對照名加入相鄰的2個孔，每份血清樣本加1孔。封板后置濕盒內于 37 ℃恒溫箱中反應 30 min。
 
6、用步驟2的方式，再一次進行洗滌。
7、加入工作濃度的 HRP-免抗豬 IgG 結合物，100 μL/孔，封板后置濕盒內于 37 ℃恒溫箱中反應30 min。
8、用步驟2的方式，再一次進行洗滌。
9、加入新配制的顯色/底物溶液（TMB-H₂O₂），100 μL/孔，封板后在 37 ℃恒溫箱中避光反應15 min。
10、加入反應終止液（1 mol/L 氫氟酸溶液或 10%SDS 溶液），100 μL/孔，終止反應。
11、光密度（OD）值測定：在酶聯免疫測定儀上讀取反應板各孔波長450 nm（氫氟酸終止）或650 nm（SDS 終止）的 OD值。
 
四、結果判定
1、試驗成立條件:陽性血清對照平均 OD 值與陰性血清對照平均 OD 值的差值≥0.15 時，試驗成立。否則，應重新進行試驗。
2、計算血清樣本的 S/P比值。若被檢血清樣本的 S/P比值≥0.4，判定為 PRRSV 抗體陽性。被檢血清樣本的 S/P 比值<0.3，判定為PRRSV 抗體陰性。0.3≤被檢血清樣本的 S/P 比值<0.4，判定為可疑；對可疑樣本重復檢測一次，若仍為可疑，則可判定為陽性。
血清樣本 S/P 比值的計算公式：S/P=（樣本 OD值 - 陰性血清對照平均 OD值）/（陽性血清對照平均 OD 值 - 陰性血清對照平均 OD 值）。