DAP-seq助力揭示雜交楓香再生調控新機制
2025年6月，北京林業大學張金鳳團隊在《New Phytologist》（IF=8.1）上發表了一篇題目為“BZR2-GRF5 acts as a hub module in regulating in vitro regeneration through brassinosteroid–auxin crosstalk in hybrid sweetgum”的研究論文，本文借助DAP-seq技術，揭示了BZR2-GRF5轉錄調控模塊通過組織特異性調控生長素外排基因LsfWAG2，介導油菜素內酯（BR）與生長素（IAA）信號互作，雙向調控體細胞胚胎發生（SE）與器官再生的分子機制，為木本植物再生機制研究與遺傳改良提供了全新視角。
研究背景
木本植物離體再生是種質資源擴繁、保存及遺傳改良的關鍵技術，主要通過體細胞胚胎發生（SE）和器官發生兩條途徑實現。楓香是重要林木資源，雜交楓香因生長快、木材密度高，具有顯著雜種優勢，但其再生體系存在愈傷誘導率低、芽再生效率低等問題。油菜素內酯（BR）與生長素是調控植物再生的關鍵激素，BZR轉錄因子通過靶向生長素信號組分（如PIN, ARF）影響激素合成與運輸。此前研究發現外源epiBR需與生長素聯用才能誘導雜交楓香SE，提示BZR基因可能是再生通路的關鍵調控因子，但其作用機制尚不清楚。
技術路線
研究結果
本研究利用Hidden Markov 模型從雜交楓香基因組中鑒定出8個BZR家族基因，組織特異性表達譜顯示LsfBZR1/2在胚性愈傷組織（EC）及胚胎發生階段特異性高表達。通過酵母雙雜交（Y2H）、熒光素酶互補成像（LCI）、蛋白Pull-down、亞細胞定位多種實驗，證實LsfBZR2與生長調節因子LsfGRF2/3/5存在直接蛋白互作，且發生在細胞核內。其中LsfGRF5互作效應最為顯著。GRF家族是植物生長發育的關鍵轉錄因子，提示LsfBZR1/2可能通過與GRF蛋白互作調控再生。
圖1 雜交楓香中LsfBZR1/2的表達模式及序列分析。
為了進一步驗證BZR2-GRF5模塊功能，構建了LsfBZR2及LsfGRF5過表達株系。表型分析表明，LsfBZR2-OE、LsfGRF5-OE株系均表現為鮮重增加；體細胞胚胎數量減少，且異常胚胎比例顯著升高；再生芽生長速率加快且形成密集芽簇。qRT-PCR顯示過表達株系基因表達顯著上調，且植株表型正常，證實該模塊對器官發生有正向調控作用。
圖2 過表達LsfBZR2促進雜交楓香愈傷組織增殖并抑制其胚胎發生能力。
圖3 過表達LsfBZR2正向調控雜交楓香離體器官發生中的芽再生。
圖4 LsfBZR2與雜交楓香中的LsfGRF2、LsfGRF3和LsfGRF5發生互作。
圖5 LsfGRF5增強雜交楓香的愈傷組織增殖能力，同時抑制體細胞胚胎的形成。
圖6 過表達LsfGRF5促進雜交楓香的芽再生。
圖4 LsfBZR2與雜交楓香中的LsfGRF2、LsfGRF3和LsfGRF5發生互作。
圖5 LsfGRF5增強雜交楓香的愈傷組織增殖能力，同時抑制體細胞胚胎的形成。
圖6 過表達LsfGRF5促進雜交楓香的芽再生。
為了鑒定LsfBZR2調控的下游基因，作者采用DNA親和純化測序（DAP-seq）技術來識別該轉錄因子結合的基因組DNA元件。結果顯示LsfBZR2在36,582個基因組位點高度富集，涵蓋8,454個基因。其中12.2%位于啟動子區域，核心結合基序為‘CACGTG’。GO富集結果表明，與LsfBZR2蛋白結合位點相關的基因主要富集在鋅離子穩態維持、分生組織發育、表觀遺傳學、減數分裂、乙醛酸循環和脫落酸代謝途徑。與RNA-seq數據聯合分析篩選出457個受LsfBZR2調控的差異基因，其中生長素外排載體基因LsfWAG2（Lsf07G005650）被確認為直接靶基因。qRT-PCR與LC-MS/MS結果顯示，在SE途徑中，LsfBZR2過表達抑制LsfWAG2表達，導致IAA積累，促進愈傷增殖；在器官發生途徑中，LsfBZR2激活LsfWAG2表達，加速生長素外排使IAA水平降低，從而促進芽原基形成。酵母單雜交（Y1H）與雙熒光素酶報告實驗（DLR）證實，LsfBZR2直接結合啟動子區并調控其轉錄活性。
圖7 雜交楓香中LsfBZR2可結合LsfWAG2基因啟動子以調控生長素運輸。
本研究首次建立了雜交楓香中BR-生長素信號互作的分子調控模型：BZR2-GRF5模塊通過差異化調控LsfWAG2表達，在SE中維持高生長素環境促進愈傷增殖，在器官發生中降低生長素水平以加速芽再生，形成組織特異性的雙向調控機制。這一發現為木本植物再生效率的遺傳改良提供了新靶點，并揭示了BR-生長素互作在組織特異性發育中的精準調控機制。
圖8 LsfBZR2-LsfGRF5模塊介導生長素信號調控雜交楓香植株體外再生的工作模型。
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