基于納米流式檢測技術的核酸染色策略實現HCMV與EVs的高效區分

人巨細胞病毒（herpesvirus human cytomegalovirus, HCMV）是一種廣泛傳播的皰疹病毒，全球成人中血清陽性率超 60%，可導致免疫功能低下者發生嚴重疾病，甚至致命感染。然而，HCMV 致病機制研究長期受限于核心技術瓶頸：所有體外培養的病毒制劑中都存在宿主細胞分泌的細胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs），且病毒顆粒與 EVs 在物理和生化性質上高度相似。HCMV 感染還會劫持宿主 EV 生物合成通路，導致感染細胞分泌的 EVs 攜帶晚期結構域序列的病毒蛋白，進一步模糊兩者邊界。如果不將病毒顆粒與 EVs 和污染物分離，就無法研究其功能特性。

傳統的分離手段通常是基于物理和生化性質差異，很難區分病毒和 EVs。如密度梯度離心會使病毒與 EVs 共遷移，且沒有有效的手段檢查污染物的存在；由于 EVs 和病毒的蛋白組成存在重疊，磁性捕獲或親和層析等方法并不總是具有選擇性。另一方面，常規表征方法的缺陷會加劇純化相關的挑戰，導致對 EVs 或病毒制劑中污染水平的誤判。ELISA、Western Blotting 和蛋白組學等方法展示的是所有顆粒混合物整體的集群平均結果；像電鏡這樣的單顆粒表征方法不易獲取且通量很低；病毒空斑實驗主要檢測功能完整的病毒，無法檢測非感染性病毒顆粒的污染。

近期，帝國理工團隊在 Journal of Extracellular Vesicles 發表了題為“Nano-Flow Cytometry-Guided Discrimination and Separation of Human Cytomegalovirus Virions and Extracellular Vesicles”的突破性研究。本研究開發了一種基于納米流式檢測技術（NanoFCM）的核酸染色策略，首次實現了從 HCMV 感染細胞上清的混合物中將病毒顆粒和 EVs 精準區分和同步定量分析（圖1），并據此開發高效的 HCMV 分離方法，為深入探究 EVs 及病毒相關的功能性研究開辟了新路徑。

圖1. NanoFCM 對 HCMV、DBs 與 EVs 的定性和定量分析

一、顆粒濃度和粒徑檢測
研究團隊首先利用 NanoFCM 對細胞上清中的顆粒進行無標記濃度和粒徑檢測。該方法基于側向散射信號和單顆粒檢測策略建立：側向散射強度與顆粒大小成正比，脈沖頻率則反映顆粒濃度。NanoFCM 分析顯示，與未感染細胞上清相比（圖2A），HCMV 感染細胞上清具有更多且更強的側向散射脈沖信號（圖2B），提示 HCMV 感染不僅誘導細胞分泌顆粒顯著增加，還產生更多大顆粒（圖2C, E）。粒徑分布圖分析進一步揭示，未感染組產生的 EVs 粒徑分布主要集中在 50 nm 左右（圖2D）；而 HCMV 感染組，除了 50 nm 的 EVs 主峰外，顆粒粒徑分布范圍明顯擴寬，并出現了約 140 nm 的額外峰值（圖2E），該峰值代表 HCMV 病毒顆粒和密集體（dense bodies, DBs）的存在。

圖2. 細胞上清中顆粒濃度和粒徑檢測

二、核酸染色對顆粒進行精準鑒別
為了精確區分 HCMV、DBs 和 EVs，研究團隊采用核酸染料 SYTO 13、SYBR Green I 和 SYBR Safe 對 HCMV 感染細胞產生的顆粒進行染色，以實現分型和定量。NanoFCM 結果顯示，未感染組（圖3A）僅檢測到 EVs 群體，而 HCMV 感染組（圖3B）的二維散點圖中可以清晰區分三個特征性群體，分別是高散射光且高熒光強度的 HCMV，低散射光和不同熒光強度的 EVs，高散射光但較低熒光的 DBs。三種染料所測參數結果一致性良好（圖3C），其中 SYBR Green I 對病毒染色效果最佳，其熒光強度更高且背景熒光低，提供了更清晰的分群結果。此外，研究團隊對兩組細胞上清中的顆粒進行了透射電子顯微鏡（TEM）分析，直觀證實了未感染組中只有 EVs（圖3D），而 HCMV 感染組中則同時存在大量病毒顆粒、DBs 和 EVs（圖3E），這與 NanoFCM 數據高度一致。綜上所述，NanoFCM 可基于顆粒的熒光信號和側向散射特征，精確區分 HCMV、DBs 和 EVs，并提供可靠的定量數據，為后續分離技術的建立奠定了關鍵基礎。

圖3. NanoFCM 結合核酸染色對 HCMV、DBs 和 EVs 的鑒別

三、病毒顆粒定量和感染動力學
為了闡明 HCMV 感染過程中病毒顆粒和 EVs 的動態變化，研究團隊利用 NanoFCM 對病毒顆粒進行定量監測。如圖 4 所示，病毒顆粒濃度隨著時間推移顯著增加。同時，NanoFCM 能夠在不同感染復數（MOI）條件下準確量化這一變化過程，且其定量趨勢與 qPCR 結果一致，驗證了 NanoFCM 定量的可靠性。此外，分析不同時間點病毒顆粒的占比發現，盡管其絕對數量增加，但其占總顆粒數量的百分比始終低于 15%。這表明在 HCMV 感染細胞中，除了病毒顆粒之外，還有大量的非病毒顆粒（如 EVs）被分泌。

圖4. NanoFCM 監測病毒感染動力學

四、NanoFCM 評估病毒與 EVs 的分離方法
為了實現 HCMV、DBs 和 EVs 的有效分離，研究團隊基于它們的密度差異，優化了一種基于碘克沙醇墊高速離心的純化方法。采用 SYBR Green I 染色結合 NanoFCM 對該分離純化方法進行評估。高速離心后，NanoFCM 分析顯示 HCMV 和 DBs 主要富集于離心管底部，而 EVs 則富集在上層液體中（圖5）。TEM 表征進一步證實底部沉淀物中含有大量 HCMV 和 DBs，此外，空斑實驗表明該分離過程對病毒的感染性無顯著影響。綜上結果表明，基于密度墊的高速離心法不僅能夠高效分離 HCMV 和 EVs，還能保持病毒的感染性。

圖5. 密度墊高速離心分離病毒與 EVs

為了進一步獲得高純度 EVs 樣本，研究團隊采用尺寸排阻色譜（size exclusion chromatography, SEC）去除上清中殘留的 HCMV 和 DBs。TEM 成像顯示（圖6A, B），經 SEC 純化后，未感染組和 HCMV 感染組的 EVs 形態無明顯差異，且未觀察到 HCMV 和 DBs 存在。NanoFCM 分析（圖6C, D）進一步證實了純化后的 EVs 樣本幾乎沒有病毒顆粒污染，EVs 純度可達 96%。此外，研究發現 HCMV 感染組 EVs 產量（3.53×1012）顯著高于未感染組產量（1.43×1012），且兩組分泌的 EVs 粒徑分布存在差異。EVs 表面標志物 CD81 分析顯示，未感染組 CD81 陽性 EVs 占比為 23%，而感染組則升高至 38.5%（圖6E, F）。這些結果表明，HCMV 感染可能改變 EVs 的生發途徑。

圖6. 經 SEC 純化后 EVs 的表征

總 結
本研究基于 NanoFCM 平臺創新性地開發了一種核酸染色技術方案，首次在單顆粒水平實現了對 HCMV、DBs 與 EVs 的精準區分與同步定量分析。進一步結合碘克沙醇墊離心與 SEC 純化，建立了一套高效的病毒（HCMV/DBs）與 EVs 分離流程。這些技術突破不僅為 HCMV 相關研究奠定了關鍵方法學基礎，也為深入探索 EVs 生物學及病毒-EVs 相互作用提供了全新的技術平臺。所構建的“鑒別-分離-驗證”技術體系具有普適性，可拓展應用于其他病毒及納米顆粒研究。該研究對于推動病毒學、細胞生物學和轉化醫學的交叉融合具有重要意義，并在病毒載體開發、EVs 的靶向遞送以及臨床感染的精準監測等多領域展現出廣闊的科學價值和應用前景。

展 望
NanoFCM 憑借其極高的靈敏度，其散射通道能夠檢測低至 24 nm 二氧化硅顆粒，熒光通道則能實現單個核酸、單個抗體或單個藻紅蛋白的定量分析。相較于傳統的 qPCR 和 TEM 技術，NanoFCM 可在極短的時間內提供單顆粒水平的理化和生化定量信息，同時避免了傳統流式細胞術的集群檢測，從而顯著提升研究效率和結果的精準度。結合核酸染色或免疫熒光標記策略，該技術能夠精準區分并準確定量復雜混合物中的不同顆粒類型。此外，其純度分析功能有效評估和優化分離純化方案，提高目標產物的回收率及純度。隨著研究的深入，NanoFCM 有望在病毒學、納米藥物研發以及個性化醫療等領域發揮更為重要的作用。