NanoFCM技術(shù)在超級(jí)細(xì)菌MRSA感染新型診斷方法研究中的應(yīng)用

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）引起的感染是醫(yī)院獲得性感染的主要原因之一，對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅。MRSA 引起的器官特異性感染尤其是菌血癥及深部組織感染，其病死率高，其早期診斷與治療監(jiān)測(cè)一直是感染病領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。臨床上 MRSA 的檢測(cè)主要基于細(xì)菌分離株的表型和基因型特征。表型方法常用的細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)耗時(shí)長、靈敏度低，且僅能提供定性結(jié)果；基因型方法使用的分子診斷技術(shù)如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和宏基因組學(xué)二代測(cè)序（mNGS）雖提升了檢測(cè)速度和靈敏度，但仍存在樣本要求高、穩(wěn)定性差、無法實(shí)時(shí)反映感染狀態(tài)和治療效果等局限。因此，開發(fā)一種能夠?qū)崿F(xiàn) MRSA 感染早期診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估的新方法迫在眉睫。

細(xì)菌來源的胞外囊泡（bacterial extracellular vesicles, BEVs）因其攜帶細(xì)菌特異性信息，可經(jīng)體液無創(chuàng)獲取以及穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，被視為理想的生物標(biāo)志物來源。其中，青霉素結(jié)合蛋白 2a（PBP2a）作為由 mecA 基因編碼的耐藥性關(guān)鍵蛋白，介導(dǎo) MRSA 對(duì) β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性，具備高特異性、穩(wěn)定性和與感染程度及治療反應(yīng)相關(guān)的特征，成為識(shí)別和監(jiān)測(cè) MRSA 感染的關(guān)鍵潛在蛋白標(biāo)志物。因此，血漿中 PBP2a 陽性胞外囊泡（PBP2a⁺ EVs）有望成為 MRSA 感染的新型診斷和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)工具。然而，其精準(zhǔn)檢測(cè)仍面臨技術(shù)瓶頸：BEVs 粒徑多分布于 60-120 nm，常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)靈敏度不足，難以檢測(cè)到 200 nm 以下顆粒；電子顯微鏡可觀察形貌卻不適用于高通量定量分析，無法反映 EVs 的動(dòng)態(tài)變化。

近日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院聯(lián)合四川大學(xué)華西第二醫(yī)院和浙江省腫瘤醫(yī)院的多學(xué)科團(tuán)隊(duì)在 Journal of Extracellular Vesicles 發(fā)表了最新研究成果，突破了上述技術(shù)限制。該研究利用單顆粒納米檢測(cè)術(shù)（NanoFCM）實(shí)現(xiàn)了血液中 PBP2a⁺ EVs 的高靈敏及高通量定量分析，并探索了其作為生物標(biāo)志物區(qū)分 MRSA 和敏感金黃色葡萄球菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus, MSSA）感染的潛力。此外，通過系統(tǒng)性的動(dòng)物模型和臨床樣本驗(yàn)證，揭示了 PBP2a⁺ EVs 在感染過程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為 MRSA 感染的早期診斷和治療監(jiān)測(cè)提供了新的方向。
 

一、MRS-EVs 的分離與表征
從不同克隆型 MRSA（包括ST5、ST398）、甲氧西林耐藥表皮葡萄球菌（MRSE）和溶血葡萄球菌（MRSH）的培養(yǎng)上清中提取 BEVs，并通過透射電鏡（TEM）確認(rèn)其典型雙層膜結(jié)構(gòu)（圖1a），NanoFCM 單顆粒分析顯示 BEVs 粒徑分布主要集中在 60-120 nm，峰值為 70 nm（圖1b），符合細(xì)菌來源 EVs 的典型特征。Western blot 結(jié)果顯示，MRSA、MRSE 以及 MRSH 來源 BEVs 中均有表達(dá) PBP2a 蛋白，而 MSSA 和血漿來源 EVs 中未檢測(cè)到 PBP2a 蛋白（圖1c）；經(jīng)免疫電鏡進(jìn)一步確認(rèn) PBP2a 蛋白分布于 MRSA EVs 表面（圖1d, e）。最后，利用 NanoFCM 在單顆粒水平定量分析 PBP2a⁺ BEVs 的比例。結(jié)果顯示，MRS 來源的 EVs 中超過 40% 為 PBP2a 陽性，而 MSSA、大腸桿菌以及健康對(duì)照組幾乎檢測(cè)不到 PBP2a⁺ BEVs（圖1f）。這些結(jié)果證實(shí) PBP2a 為 MRS 來源 EVs 的特異性標(biāo)志物。
 

圖1. MRS-EVs 的綜合表征

二、PBP2a+ EVs 的細(xì)胞來源解析
為了探究血漿中 PBP2a⁺ EVs 的來源，研究團(tuán)隊(duì)通過鏈霉親和素磁珠結(jié)合生物素化的 PBP2a 抗體，從 MRSA 血流感染患者血漿中捕獲 PBP2a⁺ EVs。經(jīng) TEM 觀測(cè)到完整的形態(tài)。同時(shí)，NanoFCM 結(jié)果顯示捕獲的 PBP2a⁺ EVs 純度超 90%（圖2c）；進(jìn)一步利用 NanoFCM 檢測(cè)人源性的 EV 經(jīng)典標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn) PBP2a⁺ EVs 表達(dá)經(jīng)典標(biāo)志物（CD63、CD81、CD9、CD11）的陽性率僅 3%-5%，顯著低于健康人血漿 EVs （7%-21%，圖2d）；WB 也僅檢測(cè)出微量 TSG101（圖2e）。上述結(jié)果表明，MRSA 血流感染患者血漿中的 PBP2a⁺ EVs 主要來源于細(xì)菌，其特異性不受血漿中其他細(xì)胞來源影響，可作為 MRSA 感染的潛在標(biāo)志物。
 

圖2. 血漿中 PBP2a⁺ EVs 細(xì)胞來源鑒定

三、感染進(jìn)程中 PBP2a+ EVs 的動(dòng)態(tài)變化
選取肺炎、腦膜炎、皮膚膿腫、血流感染 4 種 BALB/c 小鼠感染模型，以 MRSA（ST398 菌株）為研究對(duì)象，MSSA 感染組為對(duì)照，并在感染后 0-72 h 內(nèi)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集血液樣本。利用 NanoFCM 分析 PBP2a⁺ EVs 比例，同時(shí)通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè) C 反應(yīng)蛋白（CRP）與白細(xì)胞介素-6（IL-6）等非特異性炎癥標(biāo)志物的水平，以驗(yàn)證 PBP2a⁺ EVs 與感染炎癥的關(guān)聯(lián)性。NanoFCM 結(jié)果顯示，所有 MRSA 感染模型小鼠血漿中 PBP2a⁺ EVs 比例均顯著高于 MSSA 感染對(duì)照組；MSSA 感染組幾乎檢測(cè)不到 PBP2a⁺ EVs，證明 PBP2a⁺ EVs 能夠特異性辨別 MRSA 感染（圖3a）。此外，在肺炎模型中，MRSA 感染后 6 h 即可檢出 PBP2a⁺ EVs，早于傳統(tǒng)炎癥標(biāo)志物的臨床預(yù)警窗口；PBP2a⁺ EVs 比例隨感染進(jìn)展逐步升高，30 h 達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，該變化趨勢(shì)與 CRP 和 IL-6 一致（圖3c-e）。PBP2a⁺ EVs 直接關(guān)聯(lián) MRSA 耐藥表型，較非特異性炎癥標(biāo)志物更能精準(zhǔn)反映 MRSA 感染的真實(shí)進(jìn)程。

圖3. 小鼠肺炎模型中 PBP2a⁺ EVs 的動(dòng)態(tài)變化

在皮膚感染繼發(fā)菌血癥模型中，小鼠局部皮膚感染 14 h 后血培養(yǎng)呈陽性，細(xì)菌菌落數(shù)隨感染時(shí)間增加而增加（圖4c）；而 NanoFCM 定量結(jié)果顯示，PBP2a⁺ EVs 在感染 2–4 h 即開始上升，且隨感染的進(jìn)展持續(xù)上升（圖4d）。此外，PBP2a⁺ EVs 的動(dòng)態(tài)變化幅度遠(yuǎn)大于 CRP 與 IL-6（圖4e, f）。上述結(jié)果表明 PBP2a⁺ EVs 能更靈敏地反映感染進(jìn)展，且可作為細(xì)菌入血前的早期預(yù)警指標(biāo)。
圖4. 感染進(jìn)展過程中小鼠血液中 PBP2a⁺ EVs 和炎癥標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化

四、治療響應(yīng)監(jiān)測(cè)與臨床驗(yàn)證
為深入探究抗生素治療 MRSA 期間血液中 PBP2a⁺ EVs 的動(dòng)態(tài)變化。研究團(tuán)隊(duì)采用小鼠肺炎模型，隨機(jī)分為萬古霉素治療組和 PBS 對(duì)照組，在 MRSA 感染后 12-72 小時(shí)內(nèi)多次檢測(cè)血漿中 PBP2a⁺ EVs 的比例。結(jié)果顯示萬古霉素治療組的血漿 PBP2a⁺ EVs 比例呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，72 h 時(shí)顯著低于 PBS 對(duì)照組（圖5g)。同時(shí)，治療組血漿中炎癥因子水平也明顯降低（圖5h, i)。此外，治療組肺組織中 Ly6G 陽性信號(hào)（中性粒細(xì)胞浸潤標(biāo)志）減少，提示肺部炎癥緩解，進(jìn)一步證實(shí) PBP2a⁺ EVs 水平變化可準(zhǔn)確反映治療效果。
 

圖5. 治療監(jiān)測(cè)

為了探究 PBP2a⁺ EVs 在人類感染中的臨床意義，研究團(tuán)隊(duì)收集健康對(duì)照者（n=20）以及 MRSA 感染患者（涵蓋呼吸道感染、組織/分泌物感染、血流感染 3 個(gè)部位，每部位 20 例），同時(shí)納入 20 例 MSSA 血流感染患者作為對(duì)照。免疫電鏡直接觀察到 MRSA 血流感染患者的血漿中存在 PBP2a⁺ EVs（圖6b, c）；NanoFCM 定量顯示，所有 MRSA 感染患者血樣中 PBP2a⁺ EVs 比例均顯著高于健康對(duì)照組及 MSSA 對(duì)照組，且在血流感染患者中最高（圖6d）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，MRSA 血流感染患者 CRP 水平顯著高于局部感染患者，且 CRP 水平與 PBP2a⁺ EVs 含量呈正相關(guān)（圖6e）；在連續(xù)監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，隨著感染緩解（體溫下降、CRP 及白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低），PBP2a⁺ EVs 水平也逐漸降低（圖6f），其變化趨勢(shì)與臨床病情改善高度一致，可實(shí)時(shí)反映治療響應(yīng)。ROC 曲線分析表明，PBP2a⁺ EVs 診斷 MRSA 血流感染的 AUC 高達(dá) 0.9350，效能突出。此外，針對(duì)呼吸道感染（AUC=0.8025）和組織感染（AUC=0.8513）同樣具備可靠的診斷能力（圖6g），表明 PBP2a⁺ EVs 既能精準(zhǔn)識(shí)別血流感染這類重癥場(chǎng)景，也能覆蓋局部感染診斷需求，為不同部位 MRSA 感染提供統(tǒng)一高效的檢測(cè)指標(biāo)。

圖6. 臨床患者中 PBP2a⁺ EVs 的診斷價(jià)值

研究意義
本研究首次系統(tǒng)闡釋了血漿中 PBP2a⁺ EVs 作為 MRSA 感染早期診斷與治療監(jiān)測(cè)的雙重價(jià)值。該策略突破了現(xiàn)有技術(shù)對(duì) MRSA 耐藥性只能定性檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)耐藥表型與感染嚴(yán)重程度的同步量化分析，具備快速、無創(chuàng)、高特異性的顯著優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，PBP2a⁺ EVs 能夠動(dòng)態(tài)反映抗生素治療過程中病原體負(fù)荷的變化，為臨床上制定個(gè)性化的精準(zhǔn)治療方案提供了客觀依據(jù)，進(jìn)而控制抗生素的使用，降低耐藥菌的產(chǎn)生和傳播。該研究不僅為開發(fā)基于 PBP2a⁺ EVs 的床旁快速檢測(cè)技術(shù)以及多耐藥因子聯(lián)合檢測(cè)策略提供了新思路，也為其他耐藥菌的標(biāo)志物挖掘與精準(zhǔn)治療奠定了重要基礎(chǔ)。

NanoFCM 展望
在本研究中，NanoFCM 不僅具備超高散射和熒光靈敏度，更能保障檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性與可重現(xiàn)性，在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了單顆粒水平對(duì)血漿中 PBP2a⁺ EVs 的高效表征，為開發(fā)基于 PBP2a⁺ EVs 的 MRSA 感染早期診斷與治療監(jiān)測(cè)提供了有力的支撐。未來可進(jìn)一步基于 NanoFCM 技術(shù)開發(fā)適用于臨床的快速檢測(cè)平臺(tái)，并將其推廣至其他耐藥菌及病原體來源 EVs 的特異性識(shí)別。NanoFCM 有望在感染病的早期預(yù)警、病情分級(jí)與個(gè)體化治療中發(fā)揮更大的作用，從而推動(dòng)臨床上感染性疾病快速診斷的標(biāo)準(zhǔn)化。