Pipetty電動移液器在動物布魯氏菌病檢測（熒光RAA）中的應用

方案摘要：本方案聚焦 Pipetty 電動移液器在動物布魯氏菌病熒光 RAA（重組酶介導等溫擴增）檢測中的應用，通過精準移液、高效分液與智能操作三大核心優勢，顯著提升檢測效率與準確性。Pipetty 憑借高精度移液及溫度補償功能，確保反應體系中引物、探針等關鍵試劑添加量的一致性，有效降低假陰性與假陽性率；其連續分液模式可使 96 孔板操作時間縮短 80%，為動物疫病快速診斷提供標準化、可追溯的解決方案，尤其適用于基層獸醫站、海關口岸等檢測場景。
 
方案詳情：
一、實驗原理
      動物布魯氏菌病熒光 RAA 檢測基于重組酶介導等溫擴增技術。在 37-42℃恒溫下，重組酶與引物結合形成復合物，識別并結合布魯氏菌 DNA 模板，解開雙鏈啟動擴增；單鏈結合蛋白穩定單鏈結構，鏈置換 DNA 聚合酶延伸新鏈，實現指數級擴增。引物或探針標記熒光基團與淬滅基團，擴增過程中熒光基團與淬滅基團分離，釋放熒光信號，通過實時監測熒光強度判斷樣本中是否存在布魯氏菌 DNA，實現快速、靈敏檢測。​
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① Ⅱ級生物安全柜。
② 干式加熱器。
③ 水浴鍋。
④ 熒光 PCR 擴增儀及配套 PCR 管。
⑤ 臺式高速冷凍離心機（離心力≥12000g）。
⑥ 冰箱（2 ℃~8 ℃、-20 ℃，-80 ℃）。
⑦ Pipetty電動移液器0.1-20 μL、1-250 μL、5-1000 μL）及無菌槍頭。
⑧ 恒溫熒光基因檢測儀及配套反應管。
⑨ 樣品前處理系統。
 
2、試劑和材料
① 熒光基礎反應單元（含重組酶,單鏈結合蛋白和 DNA 聚合酶的凍干粉）及配套緩沖液。
② 乙酸鎂（140 mmol/L）。
③ 陽性對照，為參考菌株（牛種、羊種、豬種、犬種布魯氏菌基因組以及 A19 和 S2 疫苗株等） DNA，可使用 10² CFU/mL~10³ CFU/mL 的細菌 200 μL 提取細菌DNA。
④ 陰性對照，為 ddH₂O。
 
三、實驗步驟
1、疑似布魯氏菌分離株的滅活：在生物安全柜內，用接種環從培養皿上挑取單個疑似菌落或多個經純培養的疑似菌落，加入含 200 uL的 PBS 或 ddH₂O 的離心管中，使用Pipetty電動移液器，設置自動混勻功能，吹打均勻，密封管蓋，置于干式加熱器，80 ℃滅活 2h。
 
2、將全血樣 、乳樣、組織樣、拭子樣及液體樣，進行處理后，置于干式加熱器或水浴鍋，80 ℃滅活2 h。
3、菌株及樣品 DNA提取，可采用細菌 DNA 提取試劑盒，按說明書規定程序提取樣品 DNA，也可采用酚-三氯甲烷-異戊醇抽提法，步驟如下：
a）使用Pipetty電動移液器取 200 μL 處理過的樣品放入離心管，加入裂解液（10 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaC1，0.5% SDS，200 μg/ml 蛋白酶K）200μL，56 ℃消化2h，12000g離心 20s，取上清液置于另一個管中，然后加入等體積的酚-三氯甲烷-異戊醇（25：24：1）混合物，上下顛倒3~4次混勻。
b）4℃ 7000g離心10 min，移上層液相置于另一個管中，加入 2.5倍體積預冷 70%（體積分數）乙醇，-20 ℃沉淀 30 min，12000g離心10 min，棄去液相，加入1mL 70%(體積分數）乙醇漂洗，12000g 離心 2 min~3 min，棄去液相，留取沉淀，真空或室溫干燥，加入 20μL ddH₂O，-20 ℃保存備用。
4、按表2配制RAA反應混合液。
 
5、將 40 μLRAA 反應混合液加入 RAA 熒光基礎反應單元管中。
6、將 5μL 乙酸鎂（反應催化劑）加在反應單元管蓋內側。
7、向反應單元管中依次加入 5μL 待測核酸，最后扣緊反應單元管蓋。
8、將反應單元管置于樣品前處理系統中，39 ℃下按程序運行 4 min。
9、將反應單元管放入恒溫核酸擴增檢測儀，設置擴增溫度為 39 ℃，擴增時間 30 min，每隔 20s收集熒光信號。注：樣品前處理系統和恒溫核酸擴增檢測儀提前 30 min預熱。
四、結果判定
1、同時滿足以下條件，可判定試驗成立，否則應重新試驗。
a)陽性對照出現特異性擴增曲線，擴增曲線的斜率K≥20；
b)陰性對照無特異性擴增曲線，擴增曲線的斜率K<20。
2、在滿足上述的條件下，當樣品擴增曲線的斜率 K≥20 時，可判為陽性，否則判為陰性。