Pipetty電動移液器在新城疫檢測（RT-PCR）中的應用

方案摘要：本方案聚焦 Pipetty 電動移液器于新城疫 RT-PCR 檢測的應用。通過其高精度移液，在樣本處理階段精準轉移 RNA 模板，確保逆轉錄起始模板量穩定；PCR 擴增環節，憑借連續分液等多種模式，高效完成多試劑添加，精準控制珍貴試劑用量，提升反應特異性與靈敏性。此外，Pipetty整機重量不到75g，相比同類型移液器，可以有效減輕操作人員的手部疲勞，溫度傳感器保障移液精度不受環境干擾。相比手動移液器操作，該移液器顯著提升檢測效率，降低誤差，為新城疫快速、準確診斷提供可靠支持。
 
方案詳情：
一、實驗原理
     新城疫由新城疫病毒引發，RT-PCR 技術檢測新城疫，先提取病毒 RNA，在逆轉錄酶作用下合成 cDNA。再基于 DNA 半保留復制，通過高溫變性解旋雙鏈，低溫退火使引物與 cDNA 結合，適溫延伸由 DNA 聚合酶合成新鏈。經 30 - 40 個循環，微量病毒核酸大量擴增，最后用電泳、熒光定量等方法檢測擴增產物，出現特異性條帶或達熒光閾值，即表明樣本含新城疫病毒。​
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① PCR擴增儀。
② 臺式高速冷凍離心機。
③ Ⅱ級生物安全柜。
④ 電泳儀。
⑤ 電泳槽。
⑥ 紫外凝膠成像儀。
⑦ Pipetty電動移液器1-250、5-1000、1-10ML量程。
 
1、試劑和材料
① RNA提取試劑 Trizol。也可用商品化RNA提取試劑盒，或其他等效RNA提取試劑和方法，如自動化核酸提取儀和其他配套核酸抽提試劑進行核酸提取。
② 三氯甲烷(氯仿)。
③ 異丙醇(分析純)。
④ 75%乙醇：用新開啟的無水乙醇（分析純）和DEPC處理水按3:1配制而成，-20℃預冷。
⑤ RT-PCR相關試劑：可選擇商品化試劑盒。
⑥ 陽性對照：滅活的新城疫強毒感染雞胚尿囊液。
⑦ 陰性對照：SPF雞胚尿囊液。
 
三、實驗步驟
1、取處理后的拭子樣品、組織樣品或尿囊液3000r/min離心5min，取200μL離心后的上清提取RNA。
2、病毒 RNA 提取
RNA提取應保證無細菌及核酸污染，實驗材料和容器應經過消毒處理并一次性使用。提取RNA時應避免RNA酶污染。用Trizol提取核酸RNA的操作步驟如下:
a) 在無RNA酶的1.5 mL離心管中加入 200μL檢測樣品，然后加入1mL Trizol，振蕩20s，室溫靜置 10 min。
b)加入 200 μL三氯甲烷（氯仿），顛倒混勻，室溫靜置10 min，12000r/min離心 15 min。
c)管內液體分為三層，取500μL上清液于離心管中，加入500μL預冷(-20℃)的異丙醇，顛倒混勻，靜置10min。12000r/min離心 15 min沉淀RNA，棄去所有液體（離心管在吸水紙上控干）。
d)加入700μL預冷（-20℃）的75%乙醇洗滌，顛倒混勻2次~3次。12000r/min 離心10 min。
e)調水浴至60℃。離心管在室溫下干燥至沒有水滴。加入40μL DEPC處理水，60℃水浴中作用10min，充分溶解RNA，-70℃保存或立即使用。
3、 配置RT-PCR反應體系
引物針對新城疫病毒F基因設計:

• 上游引物P1的序列為5'-ATGGGCYCCAGAYCTTCTAC-3';
• 下游引物P2的序列為5'-CTGCCACTGCTAGTTGTGATAATCC-3';
• Y為兼并堿基(Y：C/T)。

4、RT-PCR反應體系配置見表1。體系配好后蓋緊PCR反應管蓋，并做好標記。
 
5、使用Pipetty電動移液器，設置連續分液模式，按加樣順序全部加完并做三個復孔后，充分混勻，瞬時離心，使液體都沉降到PCR管底。同時設立陽性對照和陰性對照。按照下列程序進行擴增：42℃反轉錄30min；95℃預變性3min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，共進行 35次循環；最后，72℃再延伸7min。最終的 RT-PCR產物置4 ℃保存。
 
6、擴增產物電泳檢測， 1.5%瓊脂糖凝膠板的制備：稱取1.5g瓊脂糖，加入100mL1×TAE緩沖液中。加熱融化后加5μL(10 mg/mL)溴乙錠，混勻后倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5mm左右。依據樣品數選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子(膠中形成加樣孔)，放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒膠面。
7、加樣：用Pipetty取5μLPCR產物與0.5μL 10×加樣緩沖液混勻后加入瓊脂糖凝膠板的一個加樣孔中每次電泳同時設標準DNA Marker、陰性對照、陽性對照。
8、電泳：接通電源，120V恒壓電泳30 min~40 min。
9、電泳結束后，取出凝膠板置凝膠成像儀（或紫外線透射儀）上觀察并記錄結果。
五、結果判定
1、試驗成立條件：陽性對照出現535bp左右擴增條帶，同時陰性對照無擴增條帶。
2、檢測樣品出現535bp左右的目的片段（與陽性對照大小相符），判為新城疫病毒核酸陽性；
3、檢測樣品未出現目的片段，判為新城疫病毒核酸陰性。
六、NDV強毒感染的確定
對擴增到的目的片段進行序列測定，根據序列測定結果，對毒株F基因編碼的氨基酸序列進行分析。如果毒株F2蛋白的C端有“多個堿性氨基酸殘基”，F1蛋白的N端即117位為苯丙氨酸，可確定為新城疫病毒強毒感染。”多個堿性氨基酸“是指毒株F2蛋白的C端在113位到116位殘基之間至少有三個精氨酸或賴氨酸。