Pipetty在基孔肯雅病毒檢測（IGM抗體捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）中的應(yīng)用

方案摘要：本方案聚焦 Pipetty 電動(dòng)移液器在基孔肯雅病毒核酸檢測（IgM 抗體捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）中的應(yīng)用。該移液器重量輕、體積小，重量僅 75g，操作舒適。它具備高精度等量連續(xù)分液功能，能以設(shè)定移液量多次重復(fù)排出。還配備溫度控制功能，可防止手熱導(dǎo)致精度下降。在檢測流程的包被抗體分液、樣本稀釋加樣等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其可有效提升檢測效率與準(zhǔn)確性，降低實(shí)驗(yàn)誤差，為基孔肯雅病毒檢測提供可靠助力 。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
      首先用抗人IgM μ鏈抗體(捕獲抗體)包被96孔板，如果待檢血清中存在CHIKV抗IgM抗體，則與包被的捕獲抗體結(jié)合，然后再與CHIKV抗原結(jié)合，最后與加入酶標(biāo)抗CHIKV抗體結(jié)合，酶與顯色底物相互作用就會(huì)出現(xiàn)顯色反應(yīng)。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① 包被液：碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液，pH 9.6，1.59g Na2C03，和 2.93g NaHC03溶解于1L水中;
② 洗液：磷酸鹽緩沖液(PBS)，含0.05%吐溫20，pH7.2;
③ 封閉液：含5%奶粉和 0.05%吐溫 20的 PBS；
④ 包被抗體：抗人IgMμ鏈抗體；
⑤ 病毒抗原：滅活的純化 CHIKV 抗原，無感染性；
⑥ 細(xì)胞抗原：經(jīng)純化的未感染病毒細(xì)胞培養(yǎng)液；
⑦ 酶標(biāo)抗體：辣根過氧化物酶標(biāo)記的 CHIKV單克隆抗體；
⑧ 酶底物：TMB；
⑨ 終止液：2N H2S04；
⑩ 臨床標(biāo)本：急性期病人血清和/或腦脊髓液標(biāo)本；陽性和陰性血清對照。
 
1、試劑和材料
① 平底 96 孔板。
② 洗板機(jī)。
③ 酶標(biāo)儀。
④ 恒溫箱。
⑤ Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-02-1000及滅菌吸頭。
⑥ 試劑儲(chǔ)液槽。
⑦ 保鮮袋。
⑧ 吸水紙。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、用記號筆在酶標(biāo)板上標(biāo)記實(shí)驗(yàn)編號，明確每份臨床標(biāo)本的位置。
2、用 pH 9.6的包被液按1∶2 000 比例稀釋抗人 IgMμ 鏈抗體，使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液功能，按 75 μL/孔等量加入到 96 孔板的孔中，4℃孵育過夜。
 
3、倒掉抗體包被液，把板中剩余液體在吸水紙上吸干。使用連續(xù)分液功能，每孔加入封閉液 200μL，封閉反應(yīng)板。室溫孵育 30 min。
4、用洗液在自動(dòng)洗板機(jī)上洗板5次。每次洗滌要保證每孔加滿洗液。
5、病人血清用稀釋液進(jìn)行 1∶100 稀釋，腦脊髓液進(jìn)行 1：10 稀釋，然后按 50 μL/孔，使用連續(xù)分液功能，各加2孔，同時(shí)用稀釋液按1∶100比例稀釋陽性對照血清和陰性對照血清，各加2孔。37℃濕盒孵育1h。洗滌5遍。
6、稀釋病毒抗原和細(xì)胞抗原。使用連續(xù)分液功能，每排左邊1孔按 50μL /孔加入病毒抗原，更換吸頭，每排右邊1孔按 50 μL/孔加入細(xì)胞抗原，4℃濕盒孵育過夜。洗滌5遍。
7、按 50 μL/孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體，37℃濕盒孵育1h，洗板5遍。
8、所有孔中加 50 μL/孔的 TB 底物液，包括1孔未加樣的空白對照孔。避光室溫孵育 10 min。抗體陽性的孔中會(huì)逐漸顯示出藍(lán)色。
9、所有孔中加 50 μL/孔的終止液，顯示藍(lán)色的孔此時(shí)會(huì)變成黃色。把酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在450 nm 波長處讀取 OD 值。
四、結(jié)果判讀
1、如果陽性對照血清病毒抗原孔的光密度(OD)值與細(xì)胞抗原孔的 0D 值之比≥2.1，檢測結(jié)果有效;
2、如果待檢標(biāo)本病毒抗原孔的 0D 值與細(xì)胞抗原孔的 0D 值之比≥2.1，則可判定待檢標(biāo)本中 CHIKV IgM 抗體陽性。