Plant Physiol：DAP-seq助力揭示番茄果實成熟調控新機制
研究背景
番茄是全球廣泛種植的作物，其肉質果實富含類胡蘿卜素、維生素和酚類化合物，具有重要的經濟價值。成熟是一個復雜且受到嚴格調控的發育過程，會顯著改變果實的顏色、質地、風味和香氣。這一過程由植物激素和遺傳調控因子之間的復雜相互作用驅動。C2H2 型鋅指轉錄因子在植物生長、發育和抗逆性中具有重要作用，但其在果實成熟中的具體功能仍缺乏研究。
文獻解讀
2025年1月，中國農業大學園藝學院郭仰東/張娜團隊在Plant Physiology（IF=6.5）發表了題為“Protein phosphatase PP2C2 dephosphorylates transcription factor ZAT5 and modulates tomato fruit ripening”的研究論文，該研究揭示了SlPP2C2-SlZAT5模塊介導的蛋白去磷酸化修飾在調節呼吸躍變型果實成熟中的作用，本文借助DAP-seq技術，在全基因組范圍內系統鑒定了SlZAT5的結合位點，篩選出其直接調控的靶基因，解析了SlZAT5的轉錄調控機制，為改良番茄果實品質提供了理論支撐。
技術路線
研究結果
先前研究發現AdZAT5是獼猴桃果實軟化的潛在調節因子。本研究通過系統發育分析，在番茄中找到其同源基因SlZAT5，該基因含兩個保守C2H2結構域和EAR基序。RT-qPCR結果表明SlZAT5在番茄各組織均有表達，果實未成熟綠色階段表達較高、成熟時下降。SlZAT5突變體開花至破口期縮短至約43天，乙烯峰值提前、硬度下降、類胡蘿卜素積累高；SlZAT5過表達株系則延長至約47天，乙烯峰值延遲、硬度增加、類胡蘿卜素積累低，表明SlZAT5負調控番茄果實成熟。
圖1. SlZAT5負調控番茄果實成熟。
為了確定SlZAT5在果實成熟過程中的直接轉錄靶標，作者通過DAP-seq分析，在7754個基因中檢測到SlZAT5結合峰（高可信度區域）。結合RNA-seq數據，篩選出1511個受SlZAT5調控的成熟相關基因，其中包括乙烯合成基因SlACS4、細胞壁降解基因SlPL8和轉錄因子基因SlGRAS38等關鍵基因，這些基因的啟動子區域均有SlZAT5結合位點富集。進一步通過RT-qPCR、Y1H、Dual-Luc、ChIP-qPCR和EMSA多種實驗證實，SlZAT5可直接結合上述基因啟動子并抑制其表達。研究表明SlZAT5通過結合關鍵基因啟動子調控果實成熟過程。
圖2. SlZAT5直接抑制與成熟相關的基因表達。
為進一步探究SlZAT5在果實成熟中的作用，作者通過Y2H文庫篩選，鑒定出其互作蛋白SlPP2C2。同時通過BiFC、LCI、蛋白pull-down、Co-IP、蛋白亞細胞共定位多種實驗，證實了二者的相互作用，且發生在細胞核內。通過酵母轉錄激活實驗及原生質體報告系統發現，SlZAT5全長及含EAR基序的C端截短片段均無轉錄激活活性，但可抑制熒光素酶活性，表明其作為轉錄抑制因子發揮功能。以上結果明確了SlZAT5與SlPP2C2的互作關系及SlZAT5的轉錄抑制特性。
圖3. 轉錄抑制因子SlZAT5與SlPP2C2存在物理相互作用。
通過RT-qPCR檢測SlPP2C2在不同組織和果實成熟階段的表達，發現其在果實未成熟綠色（IMG）和成熟綠色（MG）階段高表達，隨成熟進程下降。研究構建了Slzat5、Slpp2c2和Slzat5-Slpp2c2突變體：Slpp2c2突變體果實成熟加速，乙烯水平、類胡蘿卜素含量升高，硬度和葉綠素含量降低。Slzat5-Slpp2c2雙突變體，經水處理果實成熟更快；而經乙烯、ACC和1-MCP處理，突變體與野生型的表型無明顯差異。結果表明SlZAT5和SlPP2C2通過調控乙烯合成控制番茄果實成熟。
圖4. SlZAT5和SlPP2C2通過調節乙烯反應來調控番茄果實的成熟。
為探究SlZAT5是否受SlPP2C2翻譯后修飾，通過WB檢測發現，SlZAT5過表達樣本中存在SlZAT5蛋白及其磷酸化形式，經磷酸酶處理后磷酸化信號消失；SlPP2C2-GFP與SlZAT5-MYC共表達時，未檢測到磷酸化條帶。進一步通過LC-MS/MS分析，確定了Ser-65為磷酸化位點。雙熒光素酶報告實驗表明，SlZAT5及去磷酸化突變體S65A可抑制下游基因活性，而磷酸化突變體S65D無此作用。此外，敲除SlPP2C2顯著上調目標基因轉錄水平。以上結果表明，SlPP2C2通過去磷酸化SlZAT5的Ser-65位點，調控其對下游成熟相關基因的轉錄抑制活性。
圖5. SlPP2C2對SlZAT5去磷酸化作用對SlZAT5轉錄活性的影響。
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