新一代成像流式技術在免疫細胞吞噬、CAR-T免疫療法等最新熱門話題中的應用
新一代成像流式技術的最新熱門應用
近年來，生命科學研究工具不斷推陳出新，新一代的測序、成像、自動化檢測等尖端技術革新了整個生命科學行業的認知維度，不僅使得經久不衰的科研話題獲得新的突破，如細胞間相互作用、自噬和細胞信號通路等，同時也為一些過去無法解決的難題提供了新思路，例如癌癥新療法CAR-T。本文精選了Nature、Science等高分文獻，探討新一代的成像流式技術在如下熱門話題中的應用。
免疫細胞吞噬
細胞間相互作用一直是免疫學中的熱點。免疫細胞可以吞噬靶細胞從而實現自我修復的功能，也可以通過受體配體結合實現不同細胞間的物質交換。由于傳統方法無法對單個細胞成像，因此細胞間相互作用的方式一直缺乏直觀有效地證據。在2009年4月16日，David Sancho等人在Nature上發表了一篇題為“Identification of a dendritic cell receptor that couples sensing of necrosis to immunity”的文章，成功的證實了樹突狀細胞通過SKY耦合C型凝集素受體CLEC9A識別并吞噬壞死細胞，并且采用量化成像流式技術識別并量化統計的細胞吞噬的情況。
圖一：通過左側成像流式結果圖可以清楚的判別細胞黏連體（’False’ postive）和發生吞噬的細胞（’True’ positive），從而排除了假陽性結果的干擾。
信號轉導
除了免疫細胞的吞噬之外，細胞間的相互作用還包括不同細胞通過配體受體的結合進行細胞間的信號轉導。最常見的是獲得性免疫反應中，T淋巴細胞與抗原遞呈細胞之間免疫突觸的形成。在正常細胞中，與免疫突觸形成相關的蛋白淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1），細胞表面抗原CD3，以及F-actin均勻分布在細胞表面；而當免疫突出形成時，這些蛋白在兩個細胞接觸的位置發生凝集。正是根據這一機制，2009年，Babak H. Hosseini等人成功的使用成像流式技術檢測到HEL多肽處理細胞可以促進免疫突觸的形成，并將科研成果發表在PNAS上。由此也證明成像流式在檢測免疫突觸形成中獨有的優勢。
圖2：
圖2A顯示，未使用HEL多肽處理的樣本中LFA-1，CD3和F-actin并沒有發生凝集，因此沒有免疫突觸形成。細胞經過HEL多肽處理后，LFA-1，CD3和F-actin并發生凝集，證明有免疫突觸形成。
圖2B的量化統計結果顯示，HEL多肽促進免疫突觸形成的結果具有統計學意義。
圖2A顯示，未使用HEL多肽處理的樣本中LFA-1，CD3和F-actin并沒有發生凝集，因此沒有免疫突觸形成。細胞經過HEL多肽處理后，LFA-1，CD3和F-actin并發生凝集，證明有免疫突觸形成。
圖2B的量化統計結果顯示，HEL多肽促進免疫突觸形成的結果具有統計學意義。
自噬
自噬是細胞在演變進化的過程中保留下來的一個分解代謝過程，其主要是將胞漿內的物質運輸到溶酶體內進而被分解代謝，藉此實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。研究自噬的傳統方法主要是通過熒光顯微鏡或者共聚焦觀察自噬小體/自噬溶酶體的形成。由于顯微鏡的視野限制，無法進行高通量樣本或者混合細胞樣本，比如臨床血液樣本進行分析。2012年，Kanchan Phadwal等人在《Autography》發表題為“A novel method for autophagy detection in primary cells”使用量化成像流式技術對人血中白細胞旳自噬進行了量化分析，并且通過對原代細胞和細胞系自噬的相關基因的研究，證實了T體細胞的自噬活性明顯高于B細胞，而隨著DNA損傷水平的升高CD8+ T細胞的自噬明顯下降。從而為隨著年齡的增長，免疫系統功能下降提供了合理的解釋。
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圖3：由圖可以看出，發生自噬的細胞LC3在細胞內發生的聚集，因此在細胞內，熒光信號為散點。加了抑制劑（Basal+I）后，自噬被抑制，因此LC3在細胞內是彌散分布的。 |
CAR-T免疫療法
新型抗腫瘤藥一直都是各大藥企的研發重點。目前臨床使用的抗癌藥物大多數為化學藥，這類藥物由于靶向性差導致患者常常會出現嚴重的不良反應以及耐藥性。盡管藥企投入了大量的人力物力，但是不得不承認傳統化學類抗腫瘤藥物的研發遇到了瓶頸。越來越多的科研人員把目光投向了免疫治療，因此嵌合抗原受體T細胞免疫療法（CAR-T）成為科研界的“寵兒”。不幸的是腫瘤表達的大多數抗原不具備腫瘤特異性，因此大多數的CAR都以腫瘤相關性抗原作為靶點，但這往往會導致“脫靶”的可能性。同時對于相關的抗原選擇也需要選擇細胞表面抗原，以避免CAR-T脫靶的可能。因此尋找腫瘤特異性的細胞表面抗原成為CAR-T研究的關鍵。Bryan W. Day等人發現受體酪氨酸激酶在多形性膠質母細胞瘤（GBM）病人中EphA3過表達并且通過調節有絲分裂原激活蛋白激酶信號通路減少腫瘤細胞的分化。幸運的是，作者通過量化成像流式技術檢測到EphA3為細胞膜蛋白，這一發現為后續的CAR-T研究提供了潛在的治療靶點。
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圖4：由成像流式圖像可以看到標記熒光的EphA3的分布區域，主要在細胞膜上，且在Integrin α6和CD133陽性的細胞中高表達。 對這些細胞進行統計學分析，證實EphA3高表達是有統計學意義的。 |
盡管傳統化學類抗腫瘤藥物的研發遇到了瓶頸，但是由于化學修飾相對簡單方便，并且經化學修飾過的抗原抗體特異性和親和力都會有所提高；因此，在CAR-T的研究中化學修飾依舊有著很大的應用潛力。耶魯大學的Patrick J. McEnaney等人設計合成了一類被稱為“synthetic antibody mimics targeting prostate cancer (SyAM-P)”的化合物，這類中等分子量（~ 7000 Da）的化合物同時具有抗體的結合與效應能力，因此可以有效的將免疫細胞和前列腺癌細胞特異性地結合在一起，從而增強免疫細胞對癌細胞的特異性識別和吞噬。這一發現于2014年12月16日發表在化學類的權威雜志JACS上，為CAR-T的研究提供了新思路。
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圖5：通過成像流式可區分發生吞噬的細胞，吞噬形成圖（右下）顯示SyAM-P可以幫助免疫細胞識別癌細胞；吞噬完成圖（右上）證明免疫細胞可以吞噬癌細胞。左圖量化分析顯示此結果是有統計學意義。 |
綜上所述，我們不難發現，單一的圖像或者單一的群體統計學數據已經無法滿足科研的需要。尤其是在精準醫療飛速發展的時代，科學家們要獲得質量更高、更為可信的數據，為臨床的診斷和治療提供有力的支持。因此不僅需要科研工作者們將個體數據與群體數據的有機結合，還要通過“眼見為實”的圖像證實所獲得的統計學結果是有意義的。量化成像流式技術將流式細胞檢測與熒光顯微成像結合于一體，既能提供細胞群的統計數據，又可以獲得單個細胞的圖像，從而提供了細胞形態學、細胞結構和亞細胞信號分布的完整信息，這預示著該技術在未來科研領域中無限的應用潛力！
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參考文獻：
1. Sancho, D., et al., Identification of a dendritic cell receptor that couples sensing of necrosis to immunity. Nature, 2009. 458(7240): 899-903
2. Hosseini, B.H., et al., Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy. Proc Natl Acad Sci USA, 2009. 106(42): 17852-7
3. Phadwal, K., et al., A novel method for autophagy detection in primary cells. Autophagy, 2012. 8(4): 677-689
4. Day, B.W., et al., EphA3 Maintains Tumorigenicity and Is a Therapeutic Target in Glioblastoma Multiforme. Cancer Cell, 2013. 23(2): 238-248
5. Bezbradica J.S., et al. A role for the ITAM signaling module in specifying cytokine-receptor functions. Nature Communication, 2014. 15(4): 333-342
6. McEnaney P.J. et al. Chemically Synthesized Molecules with the Targeting and Effector Functions of Antibodies. JACS, 2014. 136: 18034 - 18043.
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