流式細胞儀檢測細胞凋亡――Heochst 33342/PI雙染色法

基本原理
　　經固定的凋亡細胞其染色體熒光染料的DNA可染性性下降。細胞一經固定就不再是活細胞，而且細胞固定過程對細胞膜的通透性也有影響。因此發展了用“細胞活性”鑒定染料染色的流式細胞儀檢測方法。這些方法細胞不經固定就直接用DNA染料染色，且染料的濃度要比固定細胞所用的濃度要低得多。流式細胞儀通常根據細胞膜完整性將細胞分為“活細胞”和“死細胞”，因此正常細胞和凋亡細胞歸為活細胞�；罴毎�染料如Hoechst 33342能少許進入正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高，Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度增高的機制與凋亡細胞膜通透性發生改變有關，凋亡細胞早期細胞膜的完整性沒有明顯性改變，但細胞膜的通透性已有增強，因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342比正常細胞的多。此外，還與凋亡細胞的染色體DNA的結構發生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結合以及凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細胞外使之在細胞內積累增加等有關。既然Hoechst 33342進入凋亡細胞中比正常細胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能進入細胞膜完整的活細胞中，即正常細胞和凋亡細胞在不經固定的情況下對這些染料是拒染，壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損，可被這些染料染色。根據這些特性，用Hoechst 33342結合PI或EB等染料對凋亡細胞進行雙染色，就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區別開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，這三群細胞表現分別為：正常細胞為低藍色/低紅色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡細胞為高藍色/低紅色（Hoechst 33342++/PI+），壞死細胞為低藍色/高紅色（Hoechst 33342+/PI++）。


試劑與儀器
 Heochst 33342 染液：用PBS配成10ug/ml的儲存液濃度，4℃避光保存；
 PI染液 ：用PBS配成5ug/ml濃度，4℃避光保存。
 400目的篩網
 流式細胞儀

實驗步驟
1. 懸浮生長的細胞在培養的狀態下加入Heochst 33342 ，終濃度為1ug/ml； 37℃孵育7—10min。
2. 低溫500 ~ 1000r/min離心5min棄去染液。
3. 加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。
4. 400目的篩網過濾1次。
5. 流式細胞儀分析：Heochst 33342用氪激光激發的紫外線熒光，激發光波波長為352nm，發射光波波長為400 ~ 500nm，產生蘭色熒光；PI用氬離子激光激發熒光，激發光波波長為488nm，發射光波波長大于630nm，產生紅色熒光。分析蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。
6. 結果判斷：在蘭色熒光對紅色熒光的散點圖上，結果為：正常細胞為低藍光/低紅光，凋亡細胞為高藍光/低紅光，壞死細胞為低藍光/高紅光。

注意事項
1. 在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上，還可見到細胞凋亡區向細胞壞死區遷移的軌跡，可能是凋亡細胞的DNA進一步降解的緣故。
2. 用Heochst 33342染料與細胞孵育的時間不宜過長，一般控制在20min之內為宜。如果太長可引起Heochst 33342的發射光譜由藍光向紅光的遷移，導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變，從而影響結果的判斷。