Pipetty Pro電動移液器在玻璃酸酶測定中的應用

方案摘要：本方案結合 Pipetty Pro電動移液器核心優勢優化操作流程。以玻璃酸鉀為底物，借助該移液器 75g 超輕機身與筆式操作設計，可非等量連續分液，并提供微孔板導航功能，可一次性精準移取不同體積標準品、供試品及試劑配制溶液，適配多品牌吸頭適配性強。利用其高精度連續分液功能快速搭建反應體系，溫度自動補償技術可避免手熱導致的分液量偏差。經 37℃孵育 30 分鐘、血清反應后，640nm 測吸光度，依標準曲線計算效價。全程提升移液效率與準確性，顯著增強實驗重復性。
 
方案詳情：
一、實驗原理
      以經五氧化二磷干燥的玻璃酸鉀為底物，在 37℃±0.5℃水浴中，玻璃酸酶（標準品 / 供試品）催化其降解為小分子寡糖。反應 30 分鐘后，加入牛血清溶液 —— 未降解的大分子玻璃酸鉀會與血清蛋白結合形成穩定濁液，降解產物則不結合；濁度高低與未降解底物量正相關，在 640nm 波長下表現為吸光度差異（酶活性越高，未降解底物越少，吸光度越低）。以標準品效價與吸光度繪標準曲線，供試品吸光度對照曲線查得效價，進而計算其單位活性。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① PipettyPro電動移液器；
② 恒溫水浴鍋；
③ 玻璃試管；
④ 分光光度計。
 
2、試劑和材料
① 醋酸-醋酸鉀緩沖液
② 磷酸鹽緩沖液
③ 水解明膠；
④ 水解明膠稀釋液 ；
⑤ 血清貯備液；
⑥ 血清溶液 ；
⑦ 玻璃酸鉀貯備液；
⑧ 玻璃酸鉀溶液；
 
三、實驗步驟
1、標準品與供試品溶液制備
① 標準品溶液：使用Pipetty電動移液器，稱取標準品，加冷的水解明膠稀釋液，制成 1.5U/mL的溶液。
② 供試品溶液：按標示量稱取供試品，同法用移液器稀釋至約 1.5U/mL，避免產生氣泡。
2、標準曲線制備
① 取 12 支同規格試管，標記序號，用PipettyPro非等量電動移液器，在小程序上設置每次的分液量0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL（各 2 支平行），并儲存，即可無需切換量程，進行連續加樣操作（每管間隔 30 秒操作），對應補加水解明膠稀釋液至 0.50mL。
 
② 設置連續分液模式，每管間隔 30 秒加入玻璃酸鉀溶液 0.50mL，設置混勻模式吹吸 3 次，立即置 37℃±0.5℃水浴。
③ 準確保溫 30 分鐘后，每 30 秒取出 1 管，立即加入血清溶液 4.0mL，搖勻后室溫放置 30 分鐘。
④ 空白組：磷酸鹽緩沖液 0.50mL + 水解明膠稀釋液 0.50mL，同法操作。
⑤ 用分光光度計在 640nm 測吸光度，以吸光度為縱坐標、標準品效價為橫坐標繪標準曲線。
3、供試品測定
① 取6支試管，標記供試品組，用連續分液模式加樣：
② 使用Pipetty Pro電動移液器，在小程序上設置好每次的分液量和次數，供試品溶液 0.20、0.30、0.40mL（各 2 支平行），對應補加水解明膠稀釋液至 0.50mL。
 
③ 同標準曲線步驟，加入玻璃酸鉀溶液后水浴30分鐘，加血清溶液反應，測吸光度。
④ 從標準曲線查得效價，除以供試品重量（mg），取6份平均值即為效價（單位 /mg）。
四、結果判定
1、標準曲線的 “吸光度 - 效價” 線性回歸方程的決定系數（R²）需≥0.990，且各標準品濃度點的吸光度偏差≤±10%（即實際吸光度與理論擬合吸光度的差值不超過理論值的 10%）。
2、平行樣精密度合格供試品組中，同一取樣體積的 2 支平行管（如 2 支 0.20mL 供試品管）的吸光度差值需≤0.05（640nm 波長下），對應的單位重量效價相對偏差≤5%；6 支供試品管的整體相對標準偏差（RSD）需≤8%。
3、空白對照結果正常空白組的吸光度需穩定在 “0.100±0.020” 范圍內，且無明顯濁度異常。
4、每毫克供試品的效價不得低于 150U。若最終計算的平均效價≥150U/mg，判定為合格；若＜150U/mg，判定為不合格。
5、異常結果處理若最終效價超出預期范圍，排查后需重新取樣、重新測定，確保結果可靠。