Pipetty電動移液器在肝素凝血時間測定（APTT法）中的應用

方案摘要：本方案針對肝素凝血時間測定（APTT 法）中移液操作的精度與效率需求，引入 Pipetty 電動移液器優化試驗流程。其核心優勢在于：高精度確保樣本、APTT 試劑及氯化鈣溶液移取量精準，減少人為操作導致的凝固時間偏差；電動驅動省力設計降低長時間操作疲勞，適配多規格吸頭滿足不同試劑移取需求；避免手工操作導致的人為誤差；通過該設備應用，可顯著提升試驗重復性與結果可靠性，為肝素抗凝效果監測提供更穩定的技術支持。
 
方案詳情：
一、實驗原理
       正常血漿含內源性凝血因子，APTT 試劑中的活化劑（如白陶土）可激活內源性途徑的 Ⅻ 因子，磷脂則彌補乏血小板血漿中血小板磷脂的不足，共同啟動內源性凝血反應。加入氯化鈣（復鈣）后，凝血過程持續進行，正常情況下血漿會逐漸凝固。肝素能增強抗凝血酶 Ⅲ 活性，抑制 Ⅸa、Ⅹa、Ⅱa 等關鍵凝血因子，顯著延緩該凝血進程。通過測定從加入氯化鈣到血漿出現纖維蛋白凝塊的時間（APTT 值），可間接反映肝素對凝血系統的抑制強度，從而監測肝素抗凝效果，為臨床調整劑量提供依據。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-1000；
② 恒溫水浴箱 37℃±0.5℃；
③ 玻璃試管；
④ 采血針；
⑤ 凝血分析儀。
 
2、試劑和材料
① 肝素標準品；
② 供試品；
③ 兔血漿；
④ CaCl2試劑；
⑤ APTT試劑。
 
 
三、實驗步驟
1、標準品溶液的制備：精密稱取肝素標準品適量，按標示效價加滅菌注射用水溶解使成每1mL中含100單位的溶液，分裝于適宜的容器內，4～8℃貯存。
2、標準品稀釋液的制備：試驗當日，使用Pipetty電動移液器，精密量取標準品溶液，按高、中、低劑量組（dS₃、dS₂、dS₁）用氯化鈉注射液配制成3種濃度的稀釋液，相鄰兩濃度的比值（r）應相等；調節劑量使低劑量組各管的平均凝結時間較不加肝素對照管明顯延長，一般以大于1.5倍空白血漿的凝結時間為宜。高劑量組各管的平均凝結時間，以不超過90秒為宜，其稀釋液一般可制成每1mL中含肝素0.4～1.7單位，r為1∶0.85左右；
 
　3、供試品溶液與稀釋液的制備：按供試品的標示量或估計效價（AT），制成高、中、低(dT₃、dT₂、dT₁）3種濃度的稀釋液。相鄰兩濃度之比值（r）應與標準品相等，供試品與標準品各劑量組的凝結時間應相近。
　　4、血漿的制備：迅速收集兔或豬血置預先放有109mmol/L枸椽酸鈉溶液的容器中，枸椽酸鈉溶液與血液容積比為1∶9，邊收集邊輕輕振搖，混勻，室溫下1500×g離心不少于15分鐘（g為重力常數）。立即吸出血漿，并分成若干份分裝于適宜容器內，低溫凍結貯存。臨用時置37℃±0.5℃水浴中融化，用兩層紗布或快速濾紙過濾，使用過程中在4～8℃放置。
　5、取凝血分析儀樣品杯若干，使用Pipetty電動移液器，設置連續分液模式，每管依次加入血漿50μL、一種濃度的標準品或供試品稀釋液50μL、APTT試劑50μL，混勻，應避免產生氣泡。37℃±0.5℃預溫180秒后，每管再加入CaCl2試劑50μl，然后立即用凝血分析儀測定凝結時間，即活化部分凝血活酶時間（APTT）。標準品或供試品稀釋液每個濃度的測定次數不得少于3次，各濃度的測定次數應相同。測定時，血漿、標準品或供試品稀釋液、APTT試劑、CaCl2試劑的加入比例和預溫時間可根據儀器或試劑的說明書適當調整。測定順序以保證標準品和供試品測定的平行性為原則，應盡量保證相同濃度的標準品和供試品稀釋液的測定時間接近。
　　
 
四、結果判定
1、將上述方法測得的凝結時間換算成對數，照生物檢定統計法（通則1431）中的量反應平行線測定法計算效價及實驗誤差。
2、本法的可信限率（FL%）不得大于10%。