蛋白質(zhì)修飾位點定性分析

產(chǎn)品定義

蛋白質(zhì)修飾位點定性分析——磷酸化、糖基化位點

蛋白質(zhì)組學(xué)早期研究的絕大部分工作聚焦于細胞不同生長時期或是疾病、分裂素刺激下的蛋白質(zhì)表達水平變化。然而，許多至關(guān)重要的生命進程不僅由蛋白質(zhì)相對豐度控制，更重要的是被時空特異分布的、可逆的翻譯后修飾所調(diào)控，因而揭示翻譯后修飾發(fā)生規(guī)律是解析蛋白質(zhì)復(fù)雜多樣的生物功能的一個重要前提。

由于蛋白質(zhì)發(fā)生修飾后其分子質(zhì)量會發(fā)生相應(yīng)的改變，同時質(zhì)譜能夠精確測定蛋白質(zhì)或多肽分子質(zhì)量，根據(jù)這一特性，開始將質(zhì)譜應(yīng)用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定。但由于翻譯后修飾的蛋白質(zhì)在樣本中含量低且動態(tài)范圍廣，檢測前首先需要對修飾蛋白質(zhì)或肽段進行富集，然后才能進行質(zhì)譜鑒定。

(1) —— 蛋白質(zhì)磷酸化位點分析

(2) —— 蛋白質(zhì)N-糖基化位點分析

技術(shù)原理

——蛋白質(zhì)磷酸化位點分析

蛋白樣品中，發(fā)生磷酸化的蛋白質(zhì)和肽段含量極低，且存在各種非磷酸化肽段和無機鹽的干擾，致使檢測磷酸化蛋白和磷肽段非常困難。因此，發(fā)展新型的富集方法和富集材料對磷酸化蛋白和肽段進行快速、準確地分析具有十分重要意義。

常用的磷酸化肽富集方法有固定金屬離子親和色譜法（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）、強陰陽離子交換色譜法、免疫法和金屬氧化物富集法等。

在眾多的金屬氧化物中，TiO2是最常用、發(fā)展最成熟的一種。在酸性條件下，TiO2表面帶正電，可以與磷酸化肽發(fā)生靜電作用而達到吸附的目的。

樣品經(jīng)酶解后，用TiO2微球?qū)α姿峄�肽段進行富集，富集后的產(chǎn)物由高精度質(zhì)譜分析，并通過專業(yè)軟件完成數(shù)據(jù)檢索。

——蛋白質(zhì)N-糖基化位點分析

凝素親和法是目前糖蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用最廣泛的分離富集方法。凝集素（lectin）是一類糖結(jié)合蛋白質(zhì)，能專一識別某一特殊結(jié)構(gòu)的單糖或聚糖中特定的糖基序列而與之結(jié)合，它們與糖鏈可逆非共價結(jié)合，糖蛋白或糖肽被凝集素捕獲之后，通常用特定的單糖通過競爭結(jié)合凝集素將糖蛋白或糖肽洗脫下來。蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解后利用凝集素（lectin）富集N-糖基化肽段，然后用N-糖酰胺酶（PNGase）在H218O中切除連接在天冬酰胺殘基（Asn）上的糖鏈。該處理致使Asn分子量增加2.9890Da。最后用高精度LC-MS質(zhì)譜儀檢測脫糖后的肽段，并通過MASCOT軟件檢索數(shù)據(jù)庫，確認脫糖后分子量與其理論分子量的變化以及糖基化修飾肽段的序列，從而確定該蛋白質(zhì)的N-糖基化位點。

實驗流程

            蛋白質(zhì)磷酸化位點分析                                         蛋白質(zhì)N-糖基化位點分析

使用儀器

Thermo Scientific Q Exactive

技術(shù)優(yōu)勢

● 基于高精度的質(zhì)譜分析，對修飾位點精確鑒定

● 大規(guī)模的蛋白質(zhì)組N-糖基化位點的鑒定與分析

應(yīng)用領(lǐng)域

疾病機理研究        信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析

樣品要求

技術(shù)參考案例

[1]    Hutchinson EC, Denham EM, et al. Mapping the phosphoproteome of influenza A and B viruses by mass spectrometry. PLoS Pathog. 2012; 8(11).

[2]    Chumbalkar V, Latha K, et al. Analysis of phosphotyrosine signaling in glioblastoma identifies STAT5 as a novel downstream target of DeltaEGFR. J Proteome Res. 2011; 10(3): 1343-52.

[3]    Wang S, Wang J, et al. PKC-mediated USP phosphorylation at Ser35 modulates 20-hydroxyecdysone signaling in Drosophila. J Proteome Res. 2012; 11(12): 6187-96.