鄰位連接技術(shù)(PLA)的原理、實驗流程及在生命科學研究中的應(yīng)用

其核心技術(shù)原理在于：針對目標蛋白的特異性一抗分別與帶有互補序列的DNA探針的二抗結(jié)合。當兩個目標蛋白在細胞內(nèi)空間距離接近（<40 nm）時，其連接的DNA探針隨之靠近，在連接酶作用下環(huán)化成完整的環(huán)形DNA模板。隨后通過滾環(huán)擴增（RCA）產(chǎn)生大量單鏈DNA重復(fù)序列，并使用熒光標記的寡核苷酸探針進行檢測。最終，熒光顯微鏡下的每個熒光信號點即代表一處蛋白質(zhì)相互作用的位點，實現(xiàn)“所見即所得”的直觀分析。

二、PLA標準實驗流程

樣品制備：采用4%多聚甲醛對細胞進行固定，以保持蛋白的原始空間構(gòu)象與互作狀態(tài)，隨后使用Triton X-100進行溫和透化處理，確保抗體能夠有效進入細胞內(nèi)。

抗體孵育：依次加入針對兩個目標蛋白、來源于不同宿主的一抗，孵育后加入對應(yīng)物種特異的、偶聯(lián)有DNA探針的PLA二抗。

連接反應(yīng)：在連接酶作用下，當兩個DNA探針因蛋白互作而空間鄰近時，其末端互補序列被連接形成閉環(huán)DNA模板。

滾環(huán)擴增與熒光標記：利用Phi29 DNA聚合酶進行等溫滾環(huán)擴增，生成包含大量重復(fù)序列的DNA產(chǎn)物，隨后加入熒光標記的檢測探針進行雜交標記。

信號檢測與分析：使用共聚焦顯微鏡觀察樣本，每個互作事件顯示為一個離散的熒光點。通過統(tǒng)計單個細胞內(nèi)的熒光點數(shù)量，可實現(xiàn)對互作頻率的定量比較。

1. 細胞黏附與力學傳感機制
研究顯示，在肝癌細胞中，TNS1與整合素β1（ITGB1）的相互作用受細胞外基質(zhì)黏彈性調(diào)控。高黏彈性環(huán)境顯著增強PLA檢測到的互作信號，提示力學微環(huán)境可通過調(diào)控黏附復(fù)合物的組裝動態(tài)影響細胞行為。

2. 晝夜節(jié)律與缺氧信號整合
在人心肌細胞中，PLA證實了生物鐘核心蛋白BMAL1與缺氧誘導(dǎo)因子HIF2A在細胞核內(nèi)存在特異性相互作用，其結(jié)合強度顯著高于BMAL1與HIF1A的互作，揭示了晝夜節(jié)律與缺氧應(yīng)答在轉(zhuǎn)錄水平上的直接耦合機制。

3. DNA損傷應(yīng)答與修復(fù)
研究利用PLA技術(shù)，在DNA損傷誘導(dǎo)的HeLa和U2OS細胞中，揭示了組蛋白H1.4的去酰胺化修飾（N76D/N77D）與DNA損傷標志物γH2AX在損傷染色質(zhì)區(qū)域的高度共定位，為理解染色質(zhì)重塑在DNA損傷修復(fù)中的作用提供了直接證據(jù)。同時，PLA也用于驗證RAD52與SMARCAL1在DNA復(fù)制應(yīng)激下的核內(nèi)互作，其信號可被RAD52抑制劑顯著抑制。

4. 轉(zhuǎn)錄-復(fù)制沖突機制
在HeLa細胞中，PCNA與RNA聚合酶II（RNAPII）的核內(nèi)相互作用被PLA直接捕捉。當TIPIN或TIMELESS等復(fù)制相關(guān)因子缺失時，PLA信號增強，直觀反映了轉(zhuǎn)錄-復(fù)制沖突（TRCs）的增加；該互作信號可被轉(zhuǎn)錄抑制劑DRB顯著抑制。

5. 神經(jīng)與內(nèi)分泌系統(tǒng)信號傳導(dǎo)
在小鼠紋狀體的星形膠質(zhì)細胞中，PLA揭示了µ-crystallin（Crym）與MAP2或USP9X在胞體及突起的特異性相互作用，且該互作在中央紋狀體區(qū)域顯著增強。此外，PLA證實了FGF23與FGFR1c/FGFR3c/FGFR4在HEK293T細胞膜表面的復(fù)合物形成。

6. 細胞器膜蛋白互作與質(zhì)量調(diào)控
PLA技術(shù)成功定位了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白ARL6IP1與FAM134B在小鼠胚胎成纖維細胞及HEK293T細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜網(wǎng)絡(luò)區(qū)域的相互作用，敲除任一蛋白均導(dǎo)致信號顯著減少，驗證了其互作特異性。

7. 免疫調(diào)控與跨細胞互作
一項創(chuàng)新性研究利用PLA在T細胞與星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系中，檢測到TRAIL與死亡受體DR5在兩種細胞接觸界面上的特異性“膜-膜”相互作用，為理解免疫細胞與非免疫細胞間的直接通訊提供了可視化證據(jù)。

8. 激酶信號與酶復(fù)合物形成
在H1299細胞中，PLA驗證了ALK與RNase1在胞質(zhì)及近膜區(qū)域的相互作用，提示兩者可能形成功能性復(fù)合物參與信號傳導(dǎo)。

未來，隨著多色PLA、活細胞PLA成像以及與其他超分辨率成像技術(shù)聯(lián)用方案的發(fā)展，該技術(shù)將在解析動態(tài)、多維的細胞信號網(wǎng)絡(luò)，以及推動精準醫(yī)學和藥物靶點發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮越來越重要的作用。

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