雙光子顯微鏡的MD-FSS技術(shù)用于清醒小鼠腦600微米深層亞細胞成像

在神經(jīng)科學研究領(lǐng)域，實現(xiàn)清醒活動小鼠大腦的高分辨率成像一直是一項重大挑戰(zhàn)。組織光學像差、散射以及動物運動偽影嚴重限制了成像質(zhì)量。2025年10月，國際知名期刊《Nature Communications》在線發(fā)表了一項題為“Rapid adaptive optics enabling near noninvasive high-resolution brain imaging in awake behaving mice”的重要研究成果。該研究由Zhentao She、Yiming Fu、Yingzhu He、Gewei Yan、Wanjie Wu、Zhongya Qin和Jianan Qu組成的團隊完成，開發(fā)了一種名為“多路復用數(shù)字焦點傳感與成形”（MD-FSS）的新型快速自適應光學系統(tǒng)。

本研究提出了一種結(jié)合雙光子顯微鏡（2PM）的MD-FSS技術(shù)，能夠在約0.1秒內(nèi)完成單次像差點擴散函數(shù)（PSF）的精確測量，有效校正深層組織中的像差和散射，從而在清醒活動小鼠腦中實現(xiàn)亞細胞級分辨率成像。通過薄化顱骨窗和光學透明顱骨窗這兩種近乎無創(chuàng)的方式，研究人員成功對小鼠大腦皮層深度達600微米區(qū)域進行了高清成像，揭示了清醒與麻醉狀態(tài)下小膠質(zhì)細胞功能狀態(tài)及微血管循環(huán)動力學的顯著差異，凸顯了在無創(chuàng)條件下研究清醒動物大腦功能的重要性。

重要發(fā)現(xiàn)
01核心技術(shù)原理：MD-FSS的工作機制
MD-FSS技術(shù)的核心創(chuàng)新在于通過多光束干涉實現(xiàn)快速焦點場傳感，并結(jié)合數(shù)字相位解調(diào)并行測量PSF的復振幅。該系統(tǒng)利用聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）生成多個具有不同空間和頻率偏移的弱掃描光束，使其與一束強靜態(tài)光束在焦平面上發(fā)生干涉。通過多通道數(shù)字快速傅里葉變換（FFT）檢測技術(shù)，系統(tǒng)能夠在不同調(diào)制頻率下解析出調(diào)制干涉信號的相位和振幅。

具體而言，每個弱掃描光束的PSF通過下行采樣方式進行測量，隨后通過校準相對振幅和相位偏移，將多個下行采樣的PSF合并重建為完整采樣的PSF。基于此重建的PSF，通過相位共軛和二維FFT計算生成校正波前，從而實現(xiàn)對像差和散射的精確補償。相比傳統(tǒng)的單光束傳感與成形（SD-FSS）方法，MD-FSS將PSF測量時間從數(shù)秒縮短至約0.1秒，速度提升高達八倍，且不犧牲信噪比或校正精度。

更重要的是，在清醒活動小鼠模型中，MD-FSS展現(xiàn)了其獨特優(yōu)勢。由于小鼠運動會導致成像視場內(nèi)頻繁快速的偏移，傳統(tǒng)SD-FSS方法因測量時間較長，其PSF測量會受到運動偽影的嚴重影響，導致校正波前無法有效提升信號強度，甚至引入額外像差降低成像質(zhì)量。而MD-FSS憑借其快速測量能力，能夠在清醒小鼠中準確測量復雜像差PSF，顯著提升熒光強度和成像分辨率。

神經(jīng)元鈣活動成像：在清醒小鼠的體感皮層和視覺皮層中，研究人員對表達GCaMP6s的神經(jīng)元進行了鈣成像。經(jīng)過MD-FSS校正后，神經(jīng)元胞體輪廓和側(cè)樹突清晰可辨，頂樹突細節(jié)得到極大恢復。在觸須刺激期間，鈣瞬變信號顯示出顯著改善的強度，并與刺激強烈同步。利用無慣性遠程聚焦模塊，團隊還實現(xiàn)了準同步多平面神經(jīng)元成像，揭示了觸須刺激期間頂樹突與胞體之間的同步活動。

微血管血流動力學與神經(jīng)血管耦合：研究還關(guān)注了微血管系統(tǒng)的精細結(jié)構(gòu)成像。校正后，毛細血管結(jié)構(gòu)清晰可辨，使得能夠通過線掃描成像測量清醒小鼠腦毛細血管中的紅細胞速度。統(tǒng)計分析表明，在同一毛細血管中，麻醉狀態(tài)下的紅細胞速度顯著增加。同時，通過神經(jīng)元活動和血管擴張的雙色成像，研究揭示了在刺激期間樹突神經(jīng)元活動與穿透性小動脈直徑之間的緊密耦合關(guān)系。在視覺刺激下，盡管神經(jīng)元反應表現(xiàn)出強烈的方向選擇性，但小動脈擴張并未顯示顯著的方向選擇性。

創(chuàng)新與亮點
01突破成像速度瓶頸
MD-FSS技術(shù)的核心突破在于解決了傳統(tǒng)自適應光學技術(shù)在清醒動物成像中的速度瓶頸問題。在清醒小鼠腦中，由于動物運動導致的引導星偏移會嚴重破壞波前校正所需的穩(wěn)定信號。MD-FSS通過多光束并行探測和數(shù)字FFT解調(diào)，將PSF測量時間從傳統(tǒng)方法所需的數(shù)秒縮短至約0.1秒，顯著降低了對運動偽影的敏感性，為實現(xiàn)清醒動物高分辨率成像提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。

總結(jié)與展望
本研究開發(fā)的MD-FSS技術(shù)成功解決了在清醒活動小鼠中進行高分辨率腦成像的關(guān)鍵技術(shù)難題，通過快速自適應光學校正實現(xiàn)了近乎無創(chuàng)的深層組織成像。該技術(shù)不僅顯著提升了成像速度和精度，更在多種生物應用場景中展現(xiàn)了其獨特價值，為研究大腦在生理狀態(tài)下的真實功能活動提供了強大工具。

展望未來，MD-FSS技術(shù)具有進一步優(yōu)化的巨大潛力。當前八光束設(shè)計已實現(xiàn)0.1秒的PSF測量，但通過增加光束數(shù)量和應用更先進的射頻驅(qū)動技術(shù)，測量速度有望進一步提升。隨著硬件性能的持續(xù)改進和算法的進一步優(yōu)化，該技術(shù)有望在更廣泛的生物醫(yī)學研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，特別是在需要高時空分辨率的活體動態(tài)觀測場景中。

DOI:10.1038/s41467-025-64251-y.