Beacon單細胞光導系統在雙特異性抗體細胞株篩選和開發中的應用

雙特異性抗體的細胞株開發
雙特異性抗體（簡稱 “雙抗”）是治療性抗體領域極具創新性的分支，通過基因工程改造，可同時靶向兩個不同抗原表位。相較于傳統單克隆抗體（簡稱 “單抗”），雙抗能實現天然抗體難以達成的功能，如免疫細胞重定向、雙信號通路協同阻斷等。憑借更強的靶向性與治療效能，雙抗在腫瘤免疫治療領域表現突出。目前全球已有多款雙抗藥物獲批用于血液腫瘤及實體瘤治療，另有超百個候選藥物處于臨床研究階段，應用前景廣闊。

然而，雙抗分子的復雜結構，使其生產用細胞株開發面臨顯著挑戰：

• 分子結構復雜性導致的表達與組裝難題；
• 產量與質量的協同調控難度大；
• 細胞株穩定性風險更高。

這就對細胞株篩選的通量和篩選的效率提出了更高的要求：

• 需要篩選更多的mini-pool，才能獲得 “高表達+高正確配對率”的候選cell pool用于后續的單克隆篩選；
• 進入單克隆篩選階段后，盡早地開展“產量+質量”的同步檢測，排除“高產量但錯配率高” 的細胞克隆進入后續流程，將篩選資源聚焦在更有開發價值的細胞株上。

Beacon®平臺結合產量檢測（DiGr Assay）、雙抗正配率檢測（Bispecific Heterodimer Assay）以及聚集體檢測（Aggregation Assay），可以在細胞株篩選早期實現細胞株產量與產物質量的多維度評估，將大幅提升細胞株開發的效率和最終產物的品質。最后，Beacon®平臺的細胞株穩定性預測功能（Population Dynamics），可以減少RCB建庫成本和穩定性試驗的工作量，進一步助力雙抗細胞株的開發。以下，將展開介紹Beacon®平臺的Bispecific Heterodimer Assay的原理和應用案例。

Part.01   Beacon®單細胞光導系統
Bispecific Heterodimer Assay
雙抗正確配對比例的檢測已成為細胞株開發過程中的關鍵一環。Beacon®單細胞光導平臺，依托納米流體芯片技術和光電定位技術，可以實現自動化、高通量的細胞株開發流程。除了單細胞分離、單克隆性驗證以及高表達細胞株篩選外，Beacon®平臺的bispecific heterodimer assay可以在細胞株開發的早期檢測非對稱雙抗的正確配對比例，從而盡早地排除劣質克隆，節省后續驗證的資源和人力，提高細胞株開發的效率和項目的成功率。

Beacon®的bispecific assay是在納升流體芯片上開展的，NanoPen®微型化的體積（1.7nl）使得在細胞株開發早期開展質量檢測成為可能。通過兩次自定義的定量檢測，如分別使用熒光標記的抗原-1和抗原-2開展兩次連續檢測，分別測得兩個抗原的結合信號強度（Calibrated Pen Score），然后根據兩個抗原Calibrated Pen Score的比值，比值越接近1:1意味著正確配對的雙抗比例就越高，就可以篩選出產物正確配對比例高的優質細胞株。

圖1：Bispecific assay的檢測原理。

圖2：Bispecific assay中Calibrated Pen Score的計算過程。A）Bispecific assay下的NanoPen，其中Channel Signal與Pen Signal的采集區域由藍框標記。B）通過兩點標準曲線計算Calibrated Pen Score，其中第一個點來自參比圖像，經過背景扣除和平場校正后，該值坐標為（0,0），第二個點來自檢測圖像的Channel Signal，同樣經過背景扣除和平場校正，其中試劑濃度已事先測定。然后根據Pen Signal（信號來自游離態檢測試劑和結合態檢測試劑），就可以計算出Pen內積累的產物濃度，即為Calibrated Pen Score。

Part.02  來自Incyte的案例分享
來自美國Incyte公司的專家Wang Shu分享了他們對Beacon®平臺bispecific assay的方法學驗證工作和細胞株篩選的實例。在建立bispecific assay之前，他們已經利用Beacon®平臺開展單細胞克隆和表達量篩選，回收的細胞克隆經擴增后用Octet開展雙抗產物正配比例的檢測。雖然這個技術路線可以排除掉雙抗正配比例低的細胞株，但回收細胞克隆的擴增已經浪費了不少的時間和成本。因此，他們在Beacon®平臺上驗證和實測了bispecific assay，結果顯示bispecific assay能夠高效地篩選出優質細胞株，進一步提高了細胞株篩選的效率。

他們選取了一系列已知正確配對比例的細胞克隆、mini pool和bulk pool用于驗證。在實驗摸索階段他們發現A594-Ligand B會導致抗體聚集而無法準確檢測表達量，因此最終選擇了SpotLight Fc和A594-Ligand A開展bispecific assay。測試結果表明，Beacon®的bispecific assay測定的Arm-A:Fc比值與HPLC測定的比值具有非常高的相關性，R2達到0.89（圖3）。

圖3：Beacon®芯片上開展的bispecific assay檢測結果與CEX-HPLC結果具有很好的相關性。

接著他們選取了一個bulk pool作為起始細胞樣品，開展了正式的單細胞克隆和bispecific assay檢測。如下圖中的綠框所示，Arm-A/Fc比值在0.4-0.6，且Calibrated Pen Score數值較大（意味著產物表達量較高）的克隆被認為是“好克隆”。紅框圈出的克隆，比值偏離0.5較多，被認為是“差克隆”而被挑取出來。此外，還有一些表達量低的克隆（紫色框）也被挑取出來用于比較和驗證。

圖4：根據bispecific assay從bulk pool中挑取三組克隆。

初步驗證結果表明，按比值0.4-0.6去篩選克隆，可以覆蓋絕大部分的真優質克隆。該標準下被篩選出來的21個克隆中，19個克隆具有最高的產物質量（異源二聚體比例>80%）。

圖5：根據bispecific assay設定0.4-0.6的篩選范圍可以覆蓋絕大多數優質克隆。

接著他們選取了42個克隆進入Fed-batch評估，其中7個克隆通過TubeSpin Bioreactor (TPP)評估，其余35個克隆用Ambr15進行評估。然后，研究人員對36個克隆的產物開展了CEX-HPLC分析以測定正配比例，剩余6個克隆因產量不夠沒有被分析。

用Ambr15開展fed-batch分析的35個克隆中，32個克隆的產量都高于pool的平均產量，最高的克隆產量是pool均值的4倍以上，由此可見Beacon®的產量檢測可以有效地篩選出高產細胞株。

圖6：Bispecific assay篩選出高產細胞株。

最后研究人員關聯分析了36個克隆的CEX數據和Beacon®上測定的比值。結果顯示來自Good Ratio組的9個克隆都具有好的正配比例（即True Positive），真陽性率為100%。來自Bad Ratio組的26個克隆，9個具有好的正配比例（即False Negative），17個具有差的正配比例（即True Negative），因此假陽性率為34.6%。為了進一步降低假陽性率，他們重新分析數據，最后確定將bispecific assay的篩選閾值設定為0.3-0.7時，真陽性率維持100%，而假陰性率可以顯著降低到15%。因此，適當放寬篩選標準，是一種降低假陰性率的可選策略。實際操作中，可以優先導出比值接近理論值的克隆，然后再適當收集比值在兩側延伸區的克隆，從而既能夠保證真陽性率，又能降低假陰性率，保證篩選的效率和克隆的品質。

圖7：Bispecific assay實現100%的真陽性率，通過調整篩選閾值可進一步降低假陰性率。（注：圖中虛線兩側外的綠色圓點標記的是False Negative，而紅色三角形標記的是True Negative）

結 語
Incyte的案例分享，豐富地展示了Beacon®細胞株開發解決方案強大的篩選能力，通過bispecific assay可以幫助研究人員在篩選早期就能夠識別出高產且優質的細胞株，從而節省后續驗證的成本和時間，并確保了項目交付的成果。