研究成果：USP2抑制釋放CD47抑制的吞噬作用，增強抗腫瘤免疫

文獻(xiàn)信息
湖北省腫瘤生物學(xué)行為重點實驗室，湖北省腫瘤生物學(xué)行為重點實驗室，武漢大學(xué)中南醫(yī)院放射與醫(yī)學(xué)腫瘤科，醫(yī)學(xué)研究院，免疫與代謝前沿科學(xué)中心等團(tuán)隊的研究成果“USP2 inhibition unleashes CD47-restrained phagocytosis and enhances anti-tumor immunity”（抑制USP2解除CD47介導(dǎo)的吞噬抑制作用，并增強抗腫瘤免疫）在學(xué)術(shù)期刊《Nature Communications》（IF：14.7）上發(fā)表。平生公司的離活一體CT（NEMO）在論文中提供了小鼠肺部腫瘤圖像和定量分析結(jié)果。

該論文的通訊作者為張金方教授，第一作者為代盼盼老師。

文獻(xiàn)摘要
CD47/SIRPα軸傳遞“不要吃我”的信號，從而阻礙腫瘤細(xì)胞的吞噬清除。盡管靶向CD47的阻斷抗體在臨床前模型中顯示出有希望的抗腫瘤效果，但涉及人類癌癥患者的臨床試驗尚未產(chǎn)生理想的結(jié)果。探索CD47的調(diào)控機制對于設(shè)計更有效的組合療法至關(guān)重要。在這里，作者報告說，抑制USP2會促進(jìn)CD47降解并重塑腫瘤微環(huán)境（TME），從而增強抗PD-1免疫治療。從機制上講，USP2與CD47相互作用，通過去泛素化修飾使其蛋白穩(wěn)定。抑制USP2會破壞CD47的穩(wěn)定性，從而增強巨噬細(xì)胞的吞噬作用。單細(xì)胞RNA測序顯示抑制USP2重編程TME，具體表現(xiàn)為抑制USP2增加M1巨噬細(xì)胞和CD8⁺T細(xì)胞的浸潤，同時減少M2巨噬細(xì)胞的浸潤。將ML364與抗PD-1抗體聯(lián)合使用可減輕小鼠模型中的腫瘤負(fù)擔(dān)。在臨床水平上，USP2低表達(dá)預(yù)示著對抗PD-1治療的更好反應(yīng)。作者的發(fā)現(xiàn)揭示了USP2對CD47的調(diào)控機制，靶向這一信號軸可以增強抗腫瘤免疫。

實驗方法
對于原發(fā)肺腫瘤模型，KrasLS^L-G12D/+；使用Trp53^fl/fl（KP）和Kras^LSL-G12D/+Trp53^fl/fl Usp2^−/−（KPU）小鼠。KPU小鼠是通過將KP小鼠與Usp2−/-小鼠交配而產(chǎn)生的。為了誘導(dǎo)肺部腫瘤發(fā)生，用1%戊巴比妥鈉麻醉7周齡的KP和KPU小鼠，并在每只小鼠鼻內(nèi)滴注50μl PBS（含有2×10⁶pfu腺病毒Cre）。誘導(dǎo)5周后，進(jìn)行治療。在圖7a中，KP小鼠被合并并隨機分為對照組、ML364組、抗PD-1單克隆抗體組和聯(lián)合治療組。KP小鼠每三天腹腔注射抗PD-1單克隆抗體（每只小鼠100μg），共7次治療，或每天注射ML364（5mg/kg小鼠體重），共21次治療。在圖7e中，KP和KPU小鼠分別分為對照組和抗PD-1單克隆抗體治療組。KP或KPU小鼠每三天通過腹腔注射抗PD-1單克隆抗體（每只小鼠100μg）給藥，共7次治療。治療21天后，分離KP和KPU小鼠的全肺進(jìn)行H&E染色和分析。

應(yīng)用小型動物微型CT掃描儀（NEMO^®Micro-CT，平生醫(yī)療科技有限公司）掃描不同治療組的小鼠，進(jìn)行活體成像，以顯示肺部病變。簡而言之，使用2%-3%的異氟烷對動物進(jìn)行麻醉，將其放置在恒溫控制的CT床上，并通過鼻錐輸送1%-1.5%的異氟烷，使其保持麻醉狀態(tài)。小鼠處于仰臥位，使用Cruiser掃描軟件（平生醫(yī)療科技有限公司）執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)CT掃描協(xié)議。同時，使用呼吸門控墊片監(jiān)測小鼠的實時呼吸頻率，每只小鼠的總掃描時間約為10分鐘。CT掃描完成后，根據(jù)制造商的說明，按照Avatar分析軟件（平生醫(yī)療科技有限公司）程序?qū)��?shù)據(jù)集進(jìn)行重建和成像。根據(jù)儀器制造商的指南，在Avatar程序中進(jìn)行了整個肺的3D重建和重建肺的體積計算。

實驗結(jié)果
為了進(jìn)一步研究USP2抑制在體內(nèi)調(diào)節(jié)抗PD-1免疫治療中的作用，作者使用了基因工程的Kras^LSL-G12D/+；Trp53^fl/fl（KP）小鼠腫瘤模型，在鼻內(nèi)滴注表達(dá)Cre重組酶的腺病毒（Ad-Cre），誘導(dǎo)其形成原位肺腫瘤。攜帶肺腫瘤的KP小鼠接受ML364單藥，抗PD-1單克隆抗體單藥或聯(lián)合腹腔注射治療（圖7a）。與同基因小鼠LLC腫瘤模型的結(jié)果一致（圖4），與ML364或抗PD-1抗體單一療法相比，聯(lián)合治療顯著抑制了KP小鼠的腫瘤發(fā)展，具體表現(xiàn)為腫瘤面積的減小和腫瘤面積占全肺面積比例的減小（圖7b-d）。

接下來，作者在KP小鼠中基因敲除了Usp2，并探討了Usp2缺乏對肺癌進(jìn)展和免疫療法反應(yīng)的影響。為此，通過KP小鼠交配Usp2^−/−小鼠產(chǎn)生KPU小鼠（補充圖9a-d）。用抗PD-1抗體或?qū)φ誌gG治療攜帶Ad-Cre誘導(dǎo)肺腫瘤的KP和KPU小鼠（圖7e）。然后，作者對小鼠進(jìn)行了CT掃描活體成像，展示小鼠肺部病變，同時對不同治療組的小鼠全肺進(jìn)行了3D重建。隨著腫瘤侵襲鄰近正常肺組織，肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性逐漸喪失，其肺缺損體積隨腫瘤進(jìn)展呈進(jìn)行性增大。因此，重建的健康肺間質(zhì)的體積被用作自發(fā)肺癌進(jìn)展的替代標(biāo)志物。全肺體積定量顯示，與其余處理組相比，KPU聯(lián)合PD-1單克隆抗體治療組的殘余肺體積明顯更大，腫瘤進(jìn)展明顯減緩（圖7f，g）。值得注意的是，肺部的H&E染色顯示，與其他治療組小鼠相比，經(jīng)過PD-1抗體治療的KPU小鼠顯著延緩了肺部腫瘤發(fā)展（圖7h-j）。總之，這些結(jié)果表明，在KP肺癌模型中，通過其小分子抑制劑ML364或基因缺失抑制USP2使肺腫瘤對抗PD-1抗體免疫療法更敏感。

圖7|ML364或基因缺失抑制USP2克服了Kra^sLSL-G12D/+ Trp53^fl/fl（KP）小鼠對抗PD-1抗體免疫療法的耐藥性。a KP鼠原發(fā)性肺腫瘤的治療方案示意圖。KP小鼠經(jīng)鼻注射Ad-Cre，劑量為2×10⁶pfu/只。誘導(dǎo)后五周，分別用ML364（5mg/kg）、抗PD-1單克隆抗體（每只小鼠100μg）或聯(lián)合治療對小鼠進(jìn)行治療。b-d不同處理組小鼠肺組織的代表性H&E染色圖像（b），通過測量所有肺腫瘤的橫截面積來量化腫瘤大小（c），并根據(jù)每只KP小鼠的三個非連續(xù)切片計算腫瘤面積占全肺面積的比例（%）（d）。e KP和KPU小鼠原發(fā)性肺腫瘤的治療示意圖。KP和KPU小鼠經(jīng)鼻注射Ad-Cre，劑量為2×10⁶pfu/只。誘導(dǎo)五周后，按照指示用對照載體或抗PD-1單克隆抗體（每只小鼠100μg）治療小鼠。f 不同治療組KP和KPU小鼠的活體掃描肺部成像。Micro-CT掃描的三維圖像顯示肺部呈現(xiàn)灰色。g通過Avatar軟件的3D重建，使用算法提取每組小鼠的健康肺體積進(jìn)行量化。h–j不同處理組小鼠H&E染色肺組織的代表性圖像（h），通過測量所有腫瘤的橫截面積來量化腫瘤大小（i），并根據(jù)每只KP或KPU小鼠的三個非連續(xù)切片計算腫瘤面積占全肺面積的比例（%）（j）。

使用結(jié)論
先前的研究表明，USP2對多種癌癥的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用，這表明靶向USP2可能是人類癌癥的一種潛在治療策略。此外，Usp2 KO小鼠是不影響小鼠穩(wěn)態(tài)的，并且用Usp2抑制劑ML364治療小鼠沒有顯示出明顯的毒性跡象，這進(jìn)一步支持了USP2可能是癌癥治療的理想靶點的觀點。值得注意的是，在多個臨床前肺癌模型中，USP2抑制劑與抗PD-1抗體聯(lián)合治療顯著抑制肺腫瘤生長（圖4和圖7）。此外，安全性評估表明，聯(lián)合治療不會引起明顯的血液和器官系統(tǒng)毒性。這些結(jié)果與最近的文章報道結(jié)果是一致的，在同基因小鼠乳腺腫瘤模型中，USP2抑制使腫瘤對PD-1阻斷抗體更敏感，而沒有明顯的毒性，這一抗腫瘤作用主要是通過USP2-VPRBP間接上調(diào)p53和PD-L1水平來實現(xiàn)的。p53通路的激活和USP2抑制介導(dǎo)的PD-L1表達(dá)的上調(diào)也有助于形成炎癥性TME，這與作者的主要結(jié)論一致。結(jié)合作者發(fā)現(xiàn)的去泛素化酶USP2調(diào)節(jié)CD47蛋白穩(wěn)定性和腫瘤免疫微環(huán)境，這些研究為USP2抑制劑與PD-1/PD-L1阻斷抗體聯(lián)合治療改善腫瘤治療效果提供了充分的分子基礎(chǔ)。

使用設(shè)備

  Micro CT (型號：NEMO) (平生醫(yī)療科技)
影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）