文獻分享：基于runx2b基因敲除的無肌間刺團頭魴新種質創制

文獻信息
農業農村部淡水水產學院淡水動物養殖重點實驗室、湖北洪山實驗室、教育部長江經濟帶大宗水生生物產業綠色發展工程研究中心、華中農業大學湖北省魚類養殖工程技術研究中心、廣東嶺南現代農業實驗室的研究成果“Generation of blunt snout bream without intermuscular bones by runx2b gene mutation”（基于runx2b基因敲除的無肌間刺團頭魴新種質創制）在海洋與淡水生物學領域的頂級期刊《Aquaculture》雜志上發表。平生公司的離活一體CT（NEMO）在論文中提供團頭魴樣品的魚骨圖像和定量分析。該研究的通訊作者為高澤霞教授、萬世明教授。第一作者為董強、聶春紅。

文獻摘要
團頭魴（Megalobrama amblycephala）是我國重要的食草性淡水經濟魚類。其經濟價值受到肌間刺（IBs）存在的影響。作者之前的研究證明，runx2b是肌間刺形成的關鍵基因，通過敲除runx2b基因可以獲得穩定的無肌間刺斑馬魚突變體。作者發現，通過CRISPR/Cas9編輯技術，F0代runx2b突變體團頭魴肌間刺的數量顯著減少。為了進一步獲得無肌間刺的團頭魴，作者通過F0代runx2b突變體團頭魴進行自交，獲得F1代團頭魴突變體。隨后，對35尾F1代runx2b無肌間刺突變體進行基因分型，發現突變類型為：3種（靶點1）、13種（靶點2）、7種（靶點3）的，runx2b靶點1、2和3的突變效率分別為25.71%、94.28%和71.43%。茜素紅骨染色和X射線掃描分析表明，F1代runx2b無肌間刺突變體中沒有肌間刺，顯微CT分析發現，與野生型魚類相比，F1代runx2b無肌間刺突變體中其他骨骼的礦化沒有受到顯著影響（P>0.05）。RT-qPCR結果還表明，與野生型魚類相比，F1代runx2b無肌間刺突變體中骨相關基因的表達水平較低。隨后，作者使用國家標準方法在120dpf下檢測野生型團頭魴（有肌間刺）和F1代runx2b無肌間刺突變體（無肌間刺）肌肉組織的營養成分。結果表明，野生型團頭魴和F1代runx2b無肌間刺突變體在幼魚期的基本肌肉營養成分（水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分）以及大多數氨基酸和脂肪酸的含量沒有顯著差異（P>0.05）。本研究證明，runx2b基因對水產養殖魚類中肌間刺的形成起著至關重要的作用，并為獲得一種新的無肌間刺團頭魴品系奠定了重要基礎，為無肌間刺性狀在經濟型魚類中的應用提供了一個很好的例子。

實驗方法
使用MS-222對四個月大的野生型和F1代團頭魴突變體進行安樂死，并將其固定在4% PFA溶液中24小時。團頭魴的掃描是在平生醫療科技（昆山）有限公司（PINGSENG Healthcare Inc.）的Nemo Micro-CT（NMC-200）設備上完成。該設備采用錐形束CT(cone beam CT)技術，是一種能夠達到高分辨率的成像技術。使用微計算機斷層掃描（μCT）（NEMO^®micro-CT，平生醫療，中國）以50μm的體素大�。ㄊ褂�90 kV的X射線管電位，65μA的X射線強度）掃描七個魚類樣本（4 runx2b+/+，3 runx2b−/−）。掃描過程中探測器和球管圍繞樣品艙中軸做360°旋轉，并在掃描區域內進行10000次投射，整個掃描時間為3500s。在探測器捕獲圖像后，將其傳輸到計算機中，然后在Avatar軟件（版本1.7.2，PINGSENG Healthcare Inc.）上采用FDK法逆向重建出圖像，像素大小為50um×50um×50um。斑馬魚的組織密度測量是在用小鼠脛骨的標準骨密度體模（QRM Mirco CT HA，Moehrendorf，Germany）校準后進行的。使用閾值技術手動追蹤脂肪（-200 < CT值 ≤ -80）和肌肉（-80 < CT值 ≤ 280）區域。通過使用FDK算法的3D重建軟件獲得脂肪和肌肉體積的量化。在用小鼠脛骨的標準骨密度模型（QRM-MircoCT-HA，德國Moehrendorf）校準后，對團頭魴進行組織礦物質密度測量。

實驗結果
為了揭示肌間刺發育早期runx2b基因功能喪失后的肌間刺表型，通過茜素紅骨染色觀察了runx2b突變體F1代的肌間刺表型，并在45dpf的60尾runx2b突變體F1代團頭魴中發現了27尾（45%）沒有肌間刺（圖4A）。當runx2b突變體F1代生長到四月齡時，使用X射線篩選runx2b突變體F1代團頭魴個體共5000尾，最終發現316尾（6.32%）完全沒有肌間刺的團頭魴個體（圖4B）。同樣，Micro-CT結果顯示，runx2b突變體F1代團頭魴個體沒有肌間刺，而野生型有肌間刺（圖4C）。如圖4D所示，實驗結果表明，在120dpf時，野生型（有肌間刺）和runx2b突變體（無肌間刺）的其他骨元素的組織礦物質密度（TMD）值沒有顯著差異（P>0.05）。

圖4 野生型和runx2b突變個體的肌間刺表型。A、茜素紅骨染色45dpf；B、X-ray掃描；C、 Micro CT掃描。D、組織礦物質密度（TMD）值四種不同的骨元素。

使用結論
本實驗獲得的無肌間刺團頭魴F1代將為后續培育能穩定遺傳的無肌間刺團頭魴新品種奠定重要基礎，同時，本研究也是首次以團頭魴為實驗對象展開的無刺經濟型魚類新品種的研究，為無肌間刺性狀在經濟型魚類中的應用提供一個很好的例子，但runx2b調控魚類肌間刺發生發育的分子機制還有待進一步闡明。此外，因runx2b基因缺失而獲得的無肌間刺團頭魴的骨骼發育、生長、游動性能和肌肉營養成分還需要進行更全面系統的評估。

使用設備

 Micro CT (型號：NEMO) (平生醫療科技)
影像軟件：Avatar（平生醫療科技）