多通道氣液界面細胞直接暴露染毒技術-CultexRFS Compact

一種在氣-液界面，空氣與細胞直接接觸的實驗方法，由Cultex公司Aufderheide教授提出。細胞頂部表面直接暴露于一個恒流的大氣環境中，底部有培養基供給，并有恒定溫度及CO₂環境。2009年，Cultex公司提出了經典的輻射流氣道設計（Radial Flow System -Cultex^® RFS)，Cultex RFS被譽為細胞體外暴露方法中最成功的技術。

2014年，Cultex公司推出第三代細胞暴露染毒系統Cultex RFS Compact，細胞氣液界面的直接暴露。在RFS技術基礎上，compact增加了細胞培養暴露腔室數量，共計6個cell culture inserts，并分為兩組，可對其中一組（三個cell culture inserts）進行霧霾顆粒物暴露，另一組進行清潔空氣暴露的對比實驗，或6個腔室全部進行受試物/潔凈空氣的暴露實驗。

系統內6腔室徑向分布，保證顆粒物均勻的分布到每個腔室。電加熱系統為細胞體外培養提供最佳溫度條件，專門的CO₂接入單元保證細胞進行更長時間的體外暴露。系統集成到一個帶有緊鎖裝置的支架中，保證系統的氣密性。Cultex RFS Compact經過Cultex實驗室對不同受試物質氣溶膠的劑量反應（dose-response），及不同暴露時間對受試物質細胞毒性的劑量依賴（dose-dependent）進行實驗驗證，驗證實驗表明其具有高度的實驗重復性及可靠性。

材料和方法

1、  Cultex RFS Compact

2、  6.5mm或12mm的細胞培養小室（cell culture inserts）

3、  Bronkhorst高精度MFC

4、  培養基灌注系統

5、  細胞株（ATCC：ccl-185）和分離的原代正常人支氣管上皮細胞（NHBE）

       

圖 1: 兩種氣路分布的CULTEX® RFS Compact

左圖: 三個細胞培養小室（cell culture inserts）暴露于受試氣溶膠，另外三個平行暴露于潔凈空氣

右圖: 六個細胞培養小室（cell culture inserts）全部暴露于受試氣溶膠或潔凈空氣

顆粒物暴露實驗在Cultex® RFS Compact中進行，細胞接種于12孔細胞培養小室中（well cell culture insert，COSTAR®/Corning），在氣-液界面直接接觸暴露顆粒物24小時。在實   驗過程中，細胞底部持續供給培養基，并通過電加熱系統保證環境穩定在37°C。

香煙煙霧（全煙氣/氣相-K3r4F）和1.6%尼古丁液（電子煙）作為受試物質進行細胞暴露實驗。

用WST-1法測定細胞活性。對于電子香煙的細胞暴露，同時分析細胞氧化應激水平。暴露24后進行結果分析。結果與清潔空氣控制組進行對比（圖2和圖3）。兩組之間存在顯著差異，而符號（星號）定義如下：

**** p < 0.0001非常顯著,            *** p = 0.0001 – 0.001 非常顯著,

**  p = 0.001 – 0.01 很顯著,          * p = 0.01 – 0.05 顯著

圖2: 采用WST-1分析法分析香煙煙氣（全煙氣/氣相）對A549細胞的細胞毒性作用。結果與潔凈空氣控制組的對比。Data are given as means + S.D. from 3 independent experiments with 3 samples each.

對比清潔空氣，10支香煙主流煙氣降低A549細胞的活性。隨著更多數量煙氣的暴露，細胞活性逐漸減小，同時全煙對細胞活性的影響更加明顯，相比煙氣相。暴露在清潔空氣中的細胞與細胞孵化箱中細胞的活性未有明顯變化。

圖3: 香煙煙霧和1.6%尼古丁液（電子煙）對NHBE暴露后的細胞毒性作用和氧化應激反應。結果與潔凈空氣控制組的對比。Data are given as means + S.D. from 3 independent experiments with 3 samples each.

對NHBE細胞，細胞活力和氧化應激水平的影響是相對的。暴露于電子煙液的細胞，細胞活性降低并氧化應激水平的增加。主流煙氣的暴露，細胞的更低存活率和更高的氧化應激。清潔空氣控制組的細胞比孵化器內培養的細胞表現出較高的氧化應激，這是由于清潔空氣氣流對細胞的機械剪切力刺激的結果。所以，孵化器和清潔空氣控制的細胞存活率差異不顯著。

•  CULTEX® RFS Compact適用于6個 6.5 mm 或 12 mm 現有的通用細胞培養小室（COSTAR®和 Falcon®）的直接暴露。

•  每個CULTEX® RFS Compact 內可進行兩組平行實驗，三個培養小室（cell culture inserts）用于受試物，另外三個平行用于清潔空氣或不同濃度受試物。

•  數據顯示其具有良好的劑量效應和高度的實驗重復性。

•  適用于氣體為載體的各種受試物質，如香煙煙霧、納米顆粒、PM2.5、PM10、VOCs、霧霾混合物、干粉顆粒物及霧化氣溶膠等等。