GSDMD的前世今生
在討論實驗方案之前，我們先來回顧下GSDMD的前世今生。GSDMD屬于Gasdermin（GSDM）蛋白家族，除GSDMD外，還包含 GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDME/DNFA5 和 PVJK/GSDMF 蛋白，是一組結構相關的新型蛋白質。GSDM家族被認為與免疫反應相關的孔形成有關。具有 C 端抑制結構域、細胞毒性的N 端結構域和柔性連接結構域（GSDMF 除外）。其中，GSDM-N端結構域可被剪切并釋放出來，在細胞膜上形成大的寡聚孔，從而促進細胞的分解。[1]
目前的研究表明，GSDMs 參與調控各種生理和病理過程，如細胞分化、凝血、炎癥和腫瘤發生。蛋白 GSDME 和 GSDMA 也與自身免疫性疾病和某些癌癥有關。大多數 GSDMs蛋白被認為具有形成孔隙的能力。其中研究最深入的成員GSDMD蛋白已被確認為細胞焦亡的執行者[2]。焦亡是一種溶解性細胞死亡的炎癥形式，它是在形成 caspase-1 激活的炎癥體后誘發的。其特點是一種由 GSDM家族蛋白介導，激活 NOD 樣受體蛋白 3（NLRP3）炎性體，形成細胞膜孔，釋放 IL-1β 和 IL-18 [3,4]。然后由促炎性Caspases通過經典和非經典炎性體信號通路裂解的GSDMD蛋白生成GSDMD-N末端結構域（GSDMD-N），再由GSDMD-N迅速插入質膜形成活性孔[5,6]。因此，GSDMD-N 充當了細胞焦亡的最終執行者。
實驗細節
由于 GSDMD在細胞焦亡和自身免疫性疾病的炎癥中有可能存在作為驅動因素的潛力，是一個極具吸引力的藥物靶點，GSDMD成為目前研究的熱點之一。今天小優細節君就來和大家一分享一下，WB實驗中，檢測GSDMD的一些小經驗。
在WB實驗中，最常遇到的問題莫過于無條帶和有雜帶這兩大類，下面我們展開說說。
01 實驗結果無GSDMD條帶或信號很弱
GSDMD存在多種蛋白形式，包括約53 kDa附近的GSDMD前體、約31kDa的剪切體GSDMD-N、約22 kDa的剪切體GSDMD-C等，在多數的情況下無需藥物處理即可在樣本中檢測到GSDMD前體蛋白，雖然GSDMD在不同的樣本中廣泛表達，但由于表達水平可能有差異或者受到一些處理方式的影響，在檢測時也會有可能出現無條帶或信號弱的情況。這時我們可以先確定一下樣本的表達水平，通過查詢數據庫、文獻，或者進行qPCR實驗作為參考。
相比較全長GSDMD蛋白的檢測，GSDMD-N的檢測難度則更大一些。從前文的介紹中，我們不難發現，GSDMD的打孔功能主要是由N-端結構域執行的，而GSDMD-N需要經過Caspases剪切產生,因此具有活性的GSDMD-N片段通常需要適當的誘導才能產生。下圖展示了未處理的小鼠BMDM和經LPS和Nigericin處理后的小鼠BMDM樣本中，GSDMD-N的檢測情況�？梢钥吹皆谖刺幚砘騼H經LPS處理的樣本中，無法檢出GSDMD-N條帶，而在不同濃度Nigericin的處理下GSDMD-N條帶信號強度也有變化。
結合以上結果，我們在進行誘導處理時，可以留意觀察一下一些表觀變化，以期能檢出理想的信號條帶。在誘導處理時，如果可以通過肉眼觀察到細胞死亡，并且鏡檢時能觀察到細胞漲大，胞質泄露等經典的細胞焦亡形態特征，則更有可能檢測到GSDMD-N條帶。另外細胞在發生焦亡時，貼壁性會降低，可能導致部分細胞在洗滌后丟失。建議離心收集細胞培養液中的脫落細胞，并使用PBS將培養板上的細胞全部刮出離心后，一起裂解。
在判斷誘導條件干擾時，還有一個小方法，即，如果使用的一抗是可以同時識別全長和剪切體GSDMD的，那么可以看下結果中53KD附近的全長條帶是否正常。如全長蛋白正常顯影，而30KD附近無信號，則可以推斷誘導條件需要適當調整。
而更直接的排查方法，是使用陽性樣本設置對照組，進行平行實驗，這樣不僅能排查樣本自身方面的干擾項，還能同步排查實驗中的操作和試劑干擾，高效的解決實驗問題。
02 雜帶干擾影響結果判讀
出現雜帶的時候，我們首先要判斷一下這些雜帶是否為靶標條帶相關，如條帶的信號強度符合誘導處理的變化趨勢，則有可能是蛋白降解或者一抗為多克隆抗體引入的干擾，可以更換新鮮制備的樣本和單抗進行實驗。并且如果檢測樣本為組織樣本，成分比細胞樣本會更加復雜，也可能會引入雜帶干擾。如果想要進一步確定條帶的特異性，還可以通過更換樣本、設置陰性對照以及設計敲除實驗進行驗證。
另外，如果靶標蛋白的表達量較低，需要經長時間曝光顯影也有可能會導致雜帶和高背景的情況出現。值得一提的是，在檢測剪切體GSDMD-N/C時，建議同時檢測全長前體蛋白以便更準確的判斷變化趨勢，作進一步的分析
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Rabbit anti-GSDMD Polyclonal Antibody |
參考文獻：
[1] The Versatile Gasdermin Family: Their Function and Roles in Diseases
[2] Gasdermins and their role in immunity and inflammation
[3] Shi J, et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 2015;526(7575):660–665. doi: 10.1038/nature15514. - DOI - PubMed
[4] Kuang S, et al. Structure insight of GSDMD reveals the basis of GSDMD autoinhibition in cell pyroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(40):10642–10647. doi: 10.1073/pnas.1708194114. - DOI - PMC – PubMed
[5] Xu B, et al. Gasdermin D plays a key role as a pyroptosis executor of non-alcoholic steatohepatitis in humans and mice. J Hepatol. 2018;68(4):773–782. doi: 10.1016/j.jhep.2017.11.040. - DOI - PubMed
[6] De Vasconcelos NM, et al. Single-cell analysis of pyroptosis dynamics reveals conserved GSDMD-mediated subcellular events that precede plasma membrane rupture. Cell Death Differ. 2019;26(1):146–161. doi: 10.1038/s41418-018-0106-7. - DOI - PMC - PubMed
