可灌注微血管化皮膚的生物3D打印與實驗驗證

本研究針對非血管化皮膚替代品無法永久移植的問題，利用3D生物打印技術(shù)，以含人包皮成纖維細胞（FBs）、臍帶血內(nèi)皮細胞（ECs）、胎盤周細胞（PCs）的大鼠尾 I 型膠原蛋白溶液為真皮生物墨水，含人包皮角質(zhì)形成細胞（KCs）的混合培養(yǎng)基為表皮生物墨水，構(gòu)建出多層血管化皮膚移植物。體外實驗顯示，KCs 可形成成熟屏障，ECs 與 PCs 自組裝成穩(wěn)定微血管網(wǎng)絡(luò)；植入免疫缺陷小鼠后，4周內(nèi)實現(xiàn)人EC內(nèi)襯結(jié)構(gòu)與宿主微血管連接并灌注，且 PCs 的加入顯著促進表皮成熟、宿主血管侵襲及網(wǎng)狀脊形成，為慢性皮膚潰瘍治療提供新方案。

思維導(dǎo)圖

一、研究背景與目標

• 臨床痛點

美國因靜脈淤積、糖尿病等引發(fā)的皮膚潰瘍年發(fā)病率達700 萬人，且隨預(yù)期壽命延長與糖尿病患病率上升而增加。現(xiàn)有治療存在明顯缺陷：
自體皮膚移植：有效但會在取皮部位形成新傷口，且患者自身愈合能力差；
異體皮膚移植：引發(fā)強烈免疫排斥；
組織工程皮膚（如 Apligraf）：作為生長因子來源促進愈合，但因缺乏血管網(wǎng)絡(luò)，幾周內(nèi)即失效，無法永久移植。

• 研究目標

利用3D生物打印技術(shù)，構(gòu)建含可灌注微血管網(wǎng)絡(luò)的多層皮膚移植物，解決現(xiàn)有替代品的血管化缺陷，實現(xiàn)與宿主組織的長期穩(wěn)定整合。

二、核心研究方法
1. 細胞制備與表征
通過特定培養(yǎng)基分離培養(yǎng) 4 類關(guān)鍵細胞，并經(jīng)表型驗證，確保細胞功能合格，具體信息如下表：

2. 生物墨水配方優(yōu)化
真皮生物墨水：含7.0×10⁵/mL FBs、7.0×10⁵/mL ECs（含 / 不含3.5×10⁵/mL PCs），懸浮于 2.2mL 3.5mg/mL 大鼠尾 I 型膠原蛋白、150μL 胎牛血清等混合液中，4℃保存防凝膠化。

表皮生物墨水：含2×10⁶/mL KCs，溶于 1:1 KGM 與皮膚分化培養(yǎng)基（含 DMEM/F-12、10% 胎牛血清等成分）。

3. 3D生物打印流程

采用兩步打印法，具體參數(shù)如下：

Cellink BIO X

真皮層打印：使用Cellink BIOX 生物打印機，30 號鈍針頭，4℃、50kPa 壓力打印，打印后在 EGM2 培養(yǎng)基中孵育4 天，促進內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)自組裝；

表皮層打印：4 天后換 32 號鈍針頭，35kPa 壓力打印表皮生物墨水，孵育24 小時后換皮膚分化培養(yǎng)基，再培養(yǎng)4 天后植入小鼠。

4. 檢測與驗證手段
體外：熒光流式細胞術(shù)（表型）、免疫熒光顯微鏡（細胞分布 / 標記物）、活細胞成像（血管穩(wěn)定性）；

體內(nèi)：將移植物植入 6-12 周齡 SCID/bg 小鼠背側(cè)，通過尾靜脈注射熒光素 UEA-I 驗證灌注，結(jié)合 H&E 染色、免疫組化（人 CD31、CK10 等標記物）分析整合情況。

三、關(guān)鍵研究結(jié)果
1. 體外實驗結(jié)果
表皮成熟：KCs 在氣液界面（ALI）培養(yǎng)后，形成含基底層（CK14⁺）、基上層（CK10⁺）和角質(zhì)層（聚絲蛋白⁺）的多層屏障，與天然人皮膚形態(tài)一致；

血管形成：EGM2 培養(yǎng)基培養(yǎng) 4 天可誘導(dǎo) ECs 自組裝成含開放腔的 3D 微血管網(wǎng)絡(luò)，且在皮膚培養(yǎng)基中可穩(wěn)定維持50 天無退化；

PCs 作用：PCs 與 ECs 內(nèi)襯血管直接結(jié)合，顯著增加表皮厚度及基底膜成分（層粘連蛋白 5）的表達，促進 KCs 成熟。

2. 體內(nèi)實驗結(jié)果
灌注與整合：植入4 周內(nèi)，人 EC 內(nèi)襯結(jié)構(gòu)與小鼠宿主微血管吻合并實現(xiàn)灌注，UEA-I 染色證實血管通暢；

PCs 的增效作用：含 PCs 的移植物中，宿主微血管侵襲范圍更廣，表皮網(wǎng)狀脊結(jié)構(gòu)更明顯，炎癥反應(yīng)更輕；

血管的必要性：無 EC 的移植物出現(xiàn)顯著收縮（體積更小，小鼠皮膚占比更高），且無灌注血管形成。

四、研究結(jié)論與意義
核心結(jié)論
成功利用 3D 生物打印技術(shù)，以人源細胞構(gòu)建出含可灌注微血管的多層皮膚移植物，體外形態(tài)與功能接近天然皮膚；

周細胞（PCs）可增強微血管穩(wěn)定性，并通過旁分泌作用促進表皮成熟與宿主血管整合；

臍帶血 HECFC 來源的 ECs 易分離、可擴繁100倍以上，經(jīng) CRISPR/Cas9 修飾敲除 HLA 基因后，可降低免疫排斥風(fēng)險。

研究意義
突破了現(xiàn)有無血管皮膚替代品的存活限制，為慢性皮膚潰瘍的永久治療提供新方案，同時為“現(xiàn)成”（off-the-shelf）生物工程皮膚的臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

五、關(guān)鍵問題
問題 1：本研究構(gòu)建的 3D 生物打印皮膚移植物，相比現(xiàn)有組織工程皮膚（如 Apligraf），核心突破點是什么？

答案：核心突破點是解決了“血管化缺失” 的關(guān)鍵缺陷。現(xiàn)有 Apligraf 等雙層皮膚替代品缺乏皮膚血管網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致無法與宿主組織長期整合，幾周內(nèi)即失效；而本研究通過在真皮生物墨水中加入人內(nèi)皮細胞（ECs）和周細胞（PCs），實現(xiàn)了：① 體外 ECs 與 PCs 自組裝成穩(wěn)定的 3D 微血管網(wǎng)絡(luò)（可維持 50 天）；② 植入后 4 周內(nèi)與宿主微血管吻合并灌注；③ PCs 進一步增強血管穩(wěn)定性與表皮成熟。這一血管化設(shè)計使移植物具備長期存活與整合的基礎(chǔ)，克服了現(xiàn)有產(chǎn)品的核心局限。

問題 2：研究中周細胞（PCs）在血管化皮膚移植物中發(fā)揮了哪些具體作用？其作用機制可能與什么相關(guān)？
答案：PCs 的核心作用包括兩方面：① 血管穩(wěn)定作用：體外與 ECs 內(nèi)襯血管直接結(jié)合，抑制血管退化，使微血管網(wǎng)絡(luò)在皮膚培養(yǎng)基中穩(wěn)定維持 50 天；體內(nèi)促進宿主微血管對移植物的侵襲，加速移植物與宿主血管的吻合灌注。② 表皮調(diào)控作用：顯著增加表皮厚度，促進基底膜成分（層粘連蛋白 5）表達及 KCs 末端分化，使表皮形成更成熟的分層結(jié)構(gòu)與網(wǎng)狀脊。其機制可能與 PCs 分泌生長因子（如肝細胞生長因子）、基質(zhì)金屬蛋白酶及調(diào)節(jié) BMP-2 表達相關(guān)，通過旁分泌效應(yīng)調(diào)控 ECs 與 KCs 的功能。

問題 3：本研究構(gòu)建的皮膚移植物若要走向臨床應(yīng)用，還需解決哪些關(guān)鍵問題？研究中提供了哪些潛在解決方案？
答案：需解決的關(guān)鍵問題及潛在方案如下：① 免疫排斥風(fēng)險：移植物中的人 ECs 表達 HLA 抗原，可能引發(fā)宿主排斥。研究提出通過 CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除 HECFC 來源 ECs 的 HLA 基因，消除同種免疫原性；② 細胞來源與規(guī)模化：臨床需大量細胞，直接取皮不現(xiàn)實。研究發(fā)現(xiàn)臍帶血 / 外周血 HECFC 來源的 ECs 可擴繁 100 倍以上，且易分離，可替代皮膚來源細胞；③ 體外成熟與血管保留的平衡：氣液界面（ALI）培養(yǎng)雖促表皮成熟但致血管退化。研究采用兩步打印法（先培養(yǎng)真皮血管，再打印表皮），避免 ALI 對血管的破壞，兼顧兩者需求。

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