2025版《中國(guó)藥典》新方法：AUC如何成為生物藥大分子的“質(zhì)量雷達(dá)”

生物藥涵蓋激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、抗體、蛋白酶、核酸、腺相關(guān)病毒及蛋白疫苗等，相關(guān)生物制品已成為治療惡性腫瘤、自身免疫病、遺傳性疾病、糖尿病及感染性疾病等的有力武器。隨著生物藥的進(jìn)一步發(fā)展，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性亦同步升級(jí)，給表征與質(zhì)控帶來(lái)前所未有的挑戰(zhàn)。

---

0標(biāo)記、0染色、0外標(biāo)，原液直測(cè)，1 nm–6 µm顆粒無(wú)處遁形；

純度、分子量、聚集、空殼、構(gòu)象、相互作用——多維數(shù)據(jù)一次給齊。

分析超速離心技術(shù)（AUC），作為諾獎(jiǎng)級(jí)的經(jīng)典方法，以第一性原理為基石，這一技術(shù)已成為2025版《中國(guó)藥典》、CDE、FDA及USP相關(guān)通則系列技術(shù)指導(dǎo)原則共同推薦的分析方法，并持續(xù)為其他分析方法的開(kāi)發(fā)提供指導(dǎo)。

AUC的構(gòu)造

AUC技術(shù)：

提供了一種強(qiáng)大而通用且無(wú)標(biāo)記的方法，廣泛用于檢測(cè)和表征各種生物大分子的關(guān)鍵物理屬性。它能夠直接、高分辨率地評(píng)估重組蛋白、抗體（包括裸抗、ADC）、AAV載體、腸道病毒、VLP疫苗、mRNA疫苗、多肽及小核酸藥物在溶液中的真實(shí)狀態(tài)，精確測(cè)定其粒徑分布、聚集水平和空殼率等。尤其是在接近天然環(huán)境下提供樣品的均一性、穩(wěn)定性及構(gòu)象信息方面，AUC展現(xiàn)出不可替代的優(yōu)勢(shì)，成為生物制藥研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)量控制環(huán)節(jié)中不可或缺的關(guān)鍵分析工具。

---

一、AUC作為金標(biāo)準(zhǔn)用于抗體或重組蛋白表征及質(zhì)控

1 AUC——抗體與重組蛋白SEC方法開(kāi)發(fā)的金標(biāo)準(zhǔn)

為確保SEC方法真正適配目標(biāo)生物大分子，必須在開(kāi)發(fā)階段系統(tǒng)評(píng)估潛在誤差：蛋白-填料相互作用、不可逆吸附、稀釋解聚或重聚集等。AUC作為行業(yè)公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)，可在接近天然條件下對(duì)原始溶液直接離心檢測(cè)，全程無(wú)固相基質(zhì)干擾，完美彌補(bǔ)SEC在原理上的不足。樣品通過(guò)AUC檢測(cè)后即可知道“標(biāo)準(zhǔn)答案”，根據(jù)“標(biāo)準(zhǔn)答案”進(jìn)一步指導(dǎo)其他方法的開(kāi)發(fā)。

AUC的優(yōu)勢(shì)在于：

1 在樣品原配方中完成原位分析，無(wú)需稀釋、無(wú)填料吸附，能夠一次性準(zhǔn)確量化單體、二聚體及更高階聚集體的真實(shí)比例，避免SEC等填料相互作用。

2 其次，對(duì)于大尺寸聚集體，SEC填料可能產(chǎn)生顯著吸附，回收率隨進(jìn)樣次數(shù)遞增，需多次“柱調(diào)節(jié)”才能穩(wěn)定，而AUC可為SEC方法優(yōu)化提供可靠基準(zhǔn)。

3 此外，當(dāng)SEC分辨率不足、單體與聚集體共洗脫時(shí)，AUC可將二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體及更大聚集體逐一拆分，基線清晰，避免含量被高估或漏報(bào)，從而彌補(bǔ)SEC方法分辨率不足。

4 最終，通過(guò)AUC的峰面積分布，可快速判斷聚集體增長(zhǎng)是由二聚體累積還是高階聚集體激增主導(dǎo)，為工藝優(yōu)化和穩(wěn)定性研究提供精準(zhǔn)依據(jù)。

簡(jiǎn)言之，AUC不僅為SEC方法建立“基準(zhǔn)刻度”，更是抗體分子大小變異體分辨率與定量的核心工具。關(guān)于AUC檢測(cè)抗體方法學(xué)可參考《單抗藥物分子大小變異體分析超速離心法的建立》文章。

AUC檢測(cè)單抗結(jié)果

2 AUC作為“金標(biāo)準(zhǔn)”用于ADC藥物開(kāi)發(fā)

與裸單抗相比，ADC因偶聯(lián)疏水小分子毒素，結(jié)構(gòu)更趨復(fù)雜，疏水性顯著增強(qiáng)；藥物-抗體比（DAR）越高，聚集傾向越大，且靜電相互作用進(jìn)一步加劇聚集風(fēng)險(xiǎn)。因此，在整個(gè)生命周期內(nèi)精準(zhǔn)監(jiān)控ADC聚集體含量至關(guān)重要。傳統(tǒng)SEC易受填料吸附、濃度稀釋影響——研究發(fā)現(xiàn)，隨著樣品濃度升高，SEC檢出聚體水平同步上升，表明定量失真。相比之下，AUC在原始配方緩沖液中原位檢測(cè)，無(wú)需固相基質(zhì)，聚體含量與理論值吻合，且不隨濃度變化，有效規(guī)避SEC偏差。國(guó)家藥監(jiān)局藥品審評(píng)中心2023年《抗體偶聯(lián)藥物藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》已將AUC列為ADC聚集體檢測(cè)的正交金標(biāo)準(zhǔn)。

SEC檢測(cè)ADC藥物

AUC檢測(cè)ADC藥物

---

二、病毒空殼率檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)

腺相關(guān)病毒（AAV）作為體內(nèi)基因治療首選載體，其制劑中Empty、Partial、Full及Aggregates等各類顆粒并存，雜質(zhì)與目標(biāo)顆粒粒徑差異微小，但直接影響藥效與潛在免疫原性。AUC憑借沉降系數(shù)的高分辨率，可高精度區(qū)分上述四種顆粒，并通過(guò)沉降系數(shù)值反推包裝完整性，實(shí)現(xiàn)對(duì)AAV異質(zhì)性的全景監(jiān)控。諾華全球首個(gè)獲批的AAV基因療法Zolgensma即采用AUC數(shù)據(jù)作為放行依據(jù)。

AUC檢測(cè)結(jié)果示意

Guidance Draft

---

三、用于溶瘤病毒產(chǎn)品雜質(zhì)檢測(cè)

溶瘤病毒雜質(zhì)檢測(cè)：空殼、聚集體與完整病毒等在粒徑、分子量和電荷上僅有細(xì)微差別，常規(guī)方法分辨率低、定量偏差大。AUC以沉降系數(shù)為“指紋”，可精準(zhǔn)區(qū)分各類顆粒皰疹病毒700 S→900 S→1200 S，腸道病毒80 S→120 S→150 S，一次上機(jī)即可給出定量百分比。AUC可為溶瘤病毒空殼率、聚集體雜質(zhì)控制提供高分辨率、高可信度的解決方法。

HSV AUC檢測(cè)結(jié)果舉例

腸道病毒空殼率檢測(cè)

---

四、AUC用于疫苗檢測(cè)

1 VLP疫苗: 

AUC通過(guò)沉降系數(shù)差異，可實(shí)時(shí)、定量監(jiān)測(cè)HPV疫苗顆粒的組裝效率與完整性，為工藝優(yōu)化和放行提供高分辨率質(zhì)控工具。

AUC檢測(cè)HPV VLP疫苗顆粒

2 mRNA疫苗:

AUC能夠在一次運(yùn)行中精準(zhǔn)區(qū)分片段、單體RNA與各類聚集體，并對(duì)LNP顆粒大小分布進(jìn)行高分辨率解析，從而同步識(shí)別LNP聚集體及定量測(cè)定包封率。

 AUC對(duì)mRNA原液進(jìn)行檢測(cè)

AUC對(duì)包封率進(jìn)行檢測(cè)

AUC-FV檢測(cè)LNP分布

3 其他疫苗：

亞單位疫苗、類毒素疫苗等其他疫苗同樣可借助AUC對(duì)顆粒大小、聚集程度和構(gòu)象一致性進(jìn)行高靈敏度、原位檢測(cè)，為質(zhì)量放行與穩(wěn)定性研究提供可靠數(shù)據(jù)支撐。

---

五、AUC用于多肽檢測(cè)

分析超速離心法（AUC）憑借其卓越的高分辨率檢測(cè)能力，已成為多肽藥物聚集體檢測(cè)領(lǐng)域的重要技術(shù)。國(guó)家藥監(jiān)局藥品審評(píng)中心發(fā)布的《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》正式將AUC列為推薦檢測(cè)方法，也是美國(guó)藥典通則<1503>的推薦方法，成為合成肽原料藥質(zhì)量屬性中聚集體檢測(cè)的重要手段。

GLP-1 AUC檢測(cè)結(jié)果舉例

---

六、AUC用于小核酸藥物檢測(cè)

借助AUC技術(shù)，小核酸片段的檢測(cè)變得精準(zhǔn)而高效，能夠清晰地區(qū)分出片段、目標(biāo)產(chǎn)物以及聚集體。目前，包括Patisiran Sodium、Nusinersen Sodium、Givosiran Sodium和Inclisiran Sodium在內(nèi)的小核酸藥物的指導(dǎo)草案，均已將AUC列為推薦的理化性質(zhì)分析方法。

AUC對(duì)小核酸原液檢測(cè)結(jié)果舉例

---

 

參考文獻(xiàn)
1. Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019 May;18(5):358-378

2. .Available from: https://darkhorseconsultinggroup.com/proposed-draft-guidance-for-fda-consideration

3. Qin X, Yu Q, Li X, Jiang W, Shi X, Hou W, Zhang D, Cai Z, Bi H, Fan W, Ding Y, Yang Y, Dong B, Chen L, Huo D, Wang C, Zhou Y, Pei D, Ye M, Liang C. Methodological Validation of Sedimentation Velocity Analytical Ultracentrifugation Method for Adeno-Associated Virus and Collaborative Calibration of System Suitability Substance. Hum Gene Ther. 2024 Jun;35(11-12):401-411. doi: 10.1089/hum.2023.169. Epub 2024 Jun 11. PMID: 38717948.

4. Yuan S, Wang J, Zhu D, Wang N, Gao Q, Chen W, Tang H, Wang J, Zhang X, Liu H, Rao Z, Wang X. Cryo-EM structure of a herpesvirus capsid at 3.1 Å. Science. 2018 Apr 6;360(6384):eaao7283. 

5. Yang A, Luo Y, Yang J, Xie T, Wang W, Wan X, Wang K, Pang D, Yang D, Dai H, Wu J, Meng S, Guo J, Wang Z, Shen S. Quantitation of Enterovirus A71 Empty and Full Particles by Sedimentation Velocity Analytical Ultracentrifugation. Viruses. 2024 Apr 8;16(4):573. doi: 10.3390/v16040573. PMID: 38675915; PMCID: PMC11053756.

6. Size-Exclusion Chromatography, Analytical Ultracentrifugation, and the Formulation-Dependence of ADC Aggregation. Available from: https://www.criver.com/resources/size-exclusion-chromatography-analytical-ultracentrifugation-and-formulation-dependence-adc

7. 國(guó)家藥監(jiān)局藥審中心.《抗體偶聯(lián)藥物藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》.2023

8. 俞小娟等. 單抗藥物分子大小變異體分析超速離心法的建立. 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù) (2025)

9. Weisser NE, Sanches M, Escobar-Cabrera E, O'Toole J, Whalen E, Chan PWY, Wickman G, Abraham L, Choi K, Harbourne B, Samiotakis A, Rojas AH, Volkers G, Wong J, Atkinson CE, Baardsnes J, Worrall LJ, Browman D, Smith EE, Baichoo P, Cheng CW, Guedia J, Kang S, Mukhopadhyay A, Newhook L, Ohrn A, Raghunatha P, Zago-Schmitt M, Schrag JD, Smith J, Zwierzchowski P, Scurll JM, Fung V, Black S, Strynadka NCJ, Gold MR, Presta LG, Ng G, Dixit S. An anti-HER2 biparatopic antibody that induces unique HER2 clustering and complement-dependent cytotoxicity. Nat Commun. 2023 Mar 13;14(1):1394.

10.  Pan, Huirong, et al. "Bacterially expressed human papillomavirus type 6 and 11 bivalent vaccine: characterization, antigenicity and immunogenicity." Vaccine 35.24 (2017): 3222-3231.

11. Guerrini, Giuditta, et al. "Analytical Ultracentrifugation to Assess the Quality of LNP-mRNA Therapeutics." International Journal of Molecular Sciences 25.11 (2024): 5718.

12. United States Pharmacopeia (2023). General Chapter, 〈1503〉 Quality Attributes of Synthetic Peptide Drug Substances. USP-NF. Rockville, MD: United States Pharmacopeia.

13. 國(guó)家藥監(jiān)局藥審中心.《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》.2023

14. Buckley ST, Bækdal TA, Vegge A, Maarbjerg SJ, Pyke C, Ahnfelt-Rønne J, Madsen KG, Schéele SG, Alanentalo T, Kirk RK, Pedersen BL, Skyggebjerg RB, Benie AJ, Strauss HM, Wahlund PO, Bjerregaard S, Farkas E, Fekete C, Søndergaard FL, Borregaard J, Hartoft-Nielsen ML, Knudsen LB. Transcellular stomach absorption of a derivatized glucagon-like peptide-1 receptor agonist. Sci Transl Med. 2018 Nov 14;10(467):eaar7047.

15. Analytical Ultracentrifugation Macromolecule Characterization in Solution.