使用CP-NX超速離心機和P40ST水平轉子從大鼠小腦中純化抗去污劑膜筏
Kohji Kasahara1, Shuichi Kani2, Jan Knop3, Martin Armbrecht3
1Tokyo Metropolitan Institute of Mecical Science, Tokyo, Japan; 2Eppendorf Himac Technologies, Tokyo, Japan; 3Eppendorf SE, Hamburg, Germany
圖2：CP-NX系列超速離心機(A)和P40ST水平轉子(B)
方法
膜筏組分的分離共分兩步進行：
圖3：通過一系列非連續蔗糖梯度離心步驟分離膜筏組分
結果驗證
如此前文章所述 4，可以使用 SDS-PAGE 和免疫印跡法，通過以下蛋白質標記物來檢查是否成功純化膜筏組分：
1)Csk-binding protein (Cbp) 和 Flotillin (Flt)：鑒定脂筏組分（第 3-5 號組分）
2)Calnexin (Cnx) 和 Transferrin receptor (TfR)：鑒定非脂筏組分（第 7-10 號組分）
結論
在本方案中，我們展示了如何將 CP-NX 系列超速離心機與P40ST 水平轉子以及 13 PA 離心管搭配使用，通過密度梯度離心法完成膜筏的分離。
該方法也發表在“Involvement of Gangliosides in the Process of Cbp/PAG Phosphorylation by Lyn in Developing Cerebellar Growth Cones.”一文中。
參考文獻
[1] Hartlova et al., “Membrane Rafts: A potential Gateway for Bacterial Entry into Host Cells,
” Microbiol Immunol 54 (2010): 237–245.
[2] Chazal et al., “Virus Entry, Assembly, Budding, and Membrane Rafts,” Microbiology and Molecular Biology Reviews 67,
no. 2 (June 2003): 226–237.
[3] Kohei Yuyama et al., “Translocation of Activated Heterotrimeric G Protein Gαo to Ganglioside-Enriched Detergent-
Resistant Membrane Rafts in Developing Cerebellum,” Journal of Biological Chemistry 282, no. 36 (2007): 26392–26400.
[4] Naoko Sekino-Suzuki et al., “Involvement of Gangliosides in the Process of Cbp/PAG Phosphorylation by Lyn in
Developing Cerebellar Growth Cones,” Journal of Neurochemistry 124 (2013): 514–522.
[5] Kohji Kasahara, “Physiological Functions of Glycosphingolipids in Transmembrane Signaling,” Tokyo Metropolitan
Institute of Medical Science website: https://www.igakuken.or.jp/biomembrane/english.html.
1Tokyo Metropolitan Institute of Mecical Science, Tokyo, Japan; 2Eppendorf Himac Technologies, Tokyo, Japan; 3Eppendorf SE, Hamburg, Germany
引言
本文中，我們介紹了一種使用密度梯度超速離心法分離細胞膜特殊區域⸺“ 脂筏 ”的方法（圖 1）。脂筏不同于細胞膜的其余部分，其脂質和蛋白質組分發生了改變。它們在信號轉導和調控過程中發揮著特殊作用。此外，脂筏也可能成為細菌和病毒感染的入口。1,2“ 脂筏 ”（lipid raft）一詞來源于漂浮在水面上的木筏形象，而整個細胞膜可以形象地比喻為水面。脂筏不溶于表面活性劑，可以使用非離子型表面活性劑處理，并在蔗糖密度梯度溶液中進行離心，從而從細胞膜上去除。然后，可以在中密度和低密度介質液區域對其進行回收。超速離心法是對細胞膜微結構域內的目標分子進行定位的
標準方法之一。在本文中，我們展示了搭配使用 CP-NX 系列超速離心機與P40ST 水平轉子（圖 2），通過密度梯度離心法從發育中的小腦組織中純化抗去污劑膜 (Detergent-resistant membrane，DRM) 筏的方法。3,4
圖 1：脂筏及其在膜中的典型組分概述 5（TAG-1 = 瞬時軸突糖蛋白；Goa = GTP結合蛋白的亞基家族；Lyn = Src 家族激酶；Cbp = CREB 結合蛋白）。
本文中，我們介紹了一種使用密度梯度超速離心法分離細胞膜特殊區域⸺“ 脂筏 ”的方法（圖 1）。脂筏不同于細胞膜的其余部分，其脂質和蛋白質組分發生了改變。它們在信號轉導和調控過程中發揮著特殊作用。此外，脂筏也可能成為細菌和病毒感染的入口。1,2“ 脂筏 ”（lipid raft）一詞來源于漂浮在水面上的木筏形象，而整個細胞膜可以形象地比喻為水面。脂筏不溶于表面活性劑，可以使用非離子型表面活性劑處理，并在蔗糖密度梯度溶液中進行離心，從而從細胞膜上去除。然后，可以在中密度和低密度介質液區域對其進行回收。超速離心法是對細胞膜微結構域內的目標分子進行定位的
標準方法之一。在本文中，我們展示了搭配使用 CP-NX 系列超速離心機與P40ST 水平轉子（圖 2），通過密度梯度離心法從發育中的小腦組織中純化抗去污劑膜 (Detergent-resistant membrane，DRM) 筏的方法。3,4
圖2：CP-NX系列超速離心機(A)和P40ST水平轉子(B)
方法
膜筏組分的分離共分兩步進行：
第一步，制備蔗糖密度梯度離心的樣品：
離心機和配件：
> CP-NX 系列超速離心機
> P40ST 轉子和 13PA 離心管
參數：
> 轉速：40,000 rpm (RCF: 最大 284,000 x g）
> 時間：17 h
> 溫度：4°C
> 加速模式：8
> 減速模式：8
> 樣品體積：4 mL
> 密度梯度溶液：6 mL
試劑：
> TNE 緩沖液 (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, pH 7.5)
> 含 5% (w/v) 蔗糖的 TNE 緩沖液
> 含 30% (w/v) 蔗糖的 TNE 緩沖液
Protocol:
> 將 4mL 樣品置于 13PA 離心管底部
> 向樣品中加入一層 6 mL 含 TNE 緩沖液的連續蔗糖密度梯度溶液（5%-30% [w/v]）
> 將離心管放入 P40ST 轉子中，并在 40℃下以 40,000rpm（最大 284000 x g）的速度離心 17 小時
> 離心后，按如下方式進行分餾：從頂部到底部依次收獲 1 mL 組分，共 10 份，命名為 1-10
> 脂筏 DRM 位于 3-5 號組分中（見圖 3）
> 使用 SDS-PAGE/ 免疫印跡分析法進行組分鑒定
| 樣品 預 溶解 |
試劑 | 步驟 |
| > TNE 緩沖液 (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, pH 7.5) > 含 1% (w/v) Triton X-100 的 TNE 緩沖液 > 含 80% (w/v) 蔗糖的 TNE 緩沖液 |
1. 將大鼠小腦顆粒細胞 * 懸浮于 2 mL 含 1% (w/v) Triton X-100 的 TNE 緩沖液中 2. 攪勻溶液 3. 添加含 80% (w/v) 蔗糖的 TNE 緩沖液 4. 通過上下來回吹吸混合物，徹底混合整個溶液 樣本總體積：4mL |
*原代培養大鼠小腦顆粒神經元/分離自7日齡大鼠
蔗糖密度梯度離心
提取膜筏
離心機和配件：
> CP-NX 系列超速離心機
> P40ST 轉子和 13PA 離心管
參數：
> 轉速：40,000 rpm (RCF: 最大 284,000 x g）
> 時間：17 h
> 溫度：4°C
> 加速模式：8
> 減速模式：8
> 樣品體積：4 mL
> 密度梯度溶液：6 mL
試劑：
> TNE 緩沖液 (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, pH 7.5)
> 含 5% (w/v) 蔗糖的 TNE 緩沖液
> 含 30% (w/v) 蔗糖的 TNE 緩沖液
Protocol:
> 將 4mL 樣品置于 13PA 離心管底部
> 向樣品中加入一層 6 mL 含 TNE 緩沖液的連續蔗糖密度梯度溶液（5%-30% [w/v]）
> 將離心管放入 P40ST 轉子中，并在 40℃下以 40,000rpm（最大 284000 x g）的速度離心 17 小時
> 離心后，按如下方式進行分餾：從頂部到底部依次收獲 1 mL 組分，共 10 份，命名為 1-10
> 脂筏 DRM 位于 3-5 號組分中（見圖 3）
> 使用 SDS-PAGE/ 免疫印跡分析法進行組分鑒定
完整的膜筏分離方法
圖3：通過一系列非連續蔗糖梯度離心步驟分離膜筏組分
圖3：通過一系列非連續蔗糖梯度離心步驟分離膜筏組分
結果驗證
如此前文章所述 4，可以使用 SDS-PAGE 和免疫印跡法，通過以下蛋白質標記物來檢查是否成功純化膜筏組分：
1)Csk-binding protein (Cbp) 和 Flotillin (Flt)：鑒定脂筏組分（第 3-5 號組分）
2)Calnexin (Cnx) 和 Transferrin receptor (TfR)：鑒定非脂筏組分（第 7-10 號組分）
結論
在本方案中，我們展示了如何將 CP-NX 系列超速離心機與P40ST 水平轉子以及 13 PA 離心管搭配使用，通過密度梯度離心法完成膜筏的分離。
該方法也發表在“Involvement of Gangliosides in the Process of Cbp/PAG Phosphorylation by Lyn in Developing Cerebellar Growth Cones.”一文中。
參考文獻
[1] Hartlova et al., “Membrane Rafts: A potential Gateway for Bacterial Entry into Host Cells,
” Microbiol Immunol 54 (2010): 237–245.
[2] Chazal et al., “Virus Entry, Assembly, Budding, and Membrane Rafts,” Microbiology and Molecular Biology Reviews 67,
no. 2 (June 2003): 226–237.
[3] Kohei Yuyama et al., “Translocation of Activated Heterotrimeric G Protein Gαo to Ganglioside-Enriched Detergent-
Resistant Membrane Rafts in Developing Cerebellum,” Journal of Biological Chemistry 282, no. 36 (2007): 26392–26400.
[4] Naoko Sekino-Suzuki et al., “Involvement of Gangliosides in the Process of Cbp/PAG Phosphorylation by Lyn in
Developing Cerebellar Growth Cones,” Journal of Neurochemistry 124 (2013): 514–522.
[5] Kohji Kasahara, “Physiological Functions of Glycosphingolipids in Transmembrane Signaling,” Tokyo Metropolitan
Institute of Medical Science website: https://www.igakuken.or.jp/biomembrane/english.html.
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