Western blot常用封閉液及注意事項

在做Western blot實驗中，會用到固相載體（如NC膜，PVDF膜），在這些固相載體表面有很多洞洞，通過電轉，膠上的蛋白被轉移到膜上，蛋白以機械填補（堆積）和吸附的方式結合于表面。蛋白塞進了表面的很多洞洞里面，但是蛋白并不是連續的，而有很多空隙，抗體也是蛋白，也會被吸附在空的洞里，這樣就會有很多非特異性的信號。

封閉液中的蛋白可以與固相載體表面的空白位置結合，同樣以機械填補（堆積）和吸附覆蓋的方式結合在膜上，因為有“填補”和覆蓋“蛋白結合位點以避免一抗的非特異性結合，所以有”封閉“的說法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠狠牢固的結合在空白位置上，這樣抗體蛋白就不會被非特異性的吸附到膜上，而只會跟特異性蛋白結合。

封閉液應封閉所有的未結合位點而不替換表面上的靶蛋白，不結合靶蛋白表位，也不與抗體或檢測試劑有交叉反應。

常見的封閉液：

   BSA是最常用的封閉液，成分單一適用于大多數情況。若免疫原是偶聯BSA的，BSA有很強的免疫原性，會導致產生很多針對BSA的抗體，為避免交叉反應，不能用BSA，脫脂奶粉封閉，可以選用酪蛋白或無蛋白的封閉液。

封閉血清的原理主要有兩點，第一是待測樣本有些與蛋白非特異性結合的物質，從而導致背景過高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分分特異性的結合，從這點看，BSA和血清沒有明顯區別。第二待測樣品中可能會有Fc受體，可以和抗體恒定區結合，與抗體特異性無關，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間的結合，BSA無法封閉Fc受體。

   脫脂奶粉最大的優點是價格便宜，但由于成分相對復雜，所以適用范圍要狹窄一些。磷酸化抗體也許會導致背景增加，此外，因為自身含有生物素，不能用于生物素標記的抗體系統。脫脂奶粉種含有少量的生物素和堿性磷酸酶殘留，在使用生物素-親和素系統和堿性磷酸酶標記的二抗時，也會使得高背景或本底水平增高。