多發性骨髓瘤患者樣本中抗體輕鏈的從頭測序方法
多發性骨髓瘤(MM)是一種以異常B細胞克隆擴增為特征的漿細胞惡性腫瘤[1,2]。B細胞在骨髓中積累，除了完整免疫球蛋白外，還分泌大量單克隆輕鏈(LCs)，并且15%的MM患者只產生LCs。25 kDa LCs蛋白通常由腎臟排泄或降解，但隨著單克隆數量異常曾高和腎臟清除率降低，可誘導多種LC聚集體沉積在腎臟的細胞外基質中，從而導致各種疾病。目前，無法預測LCs患者血液中發現的特定單克隆LCs的體內聚集行為。為了更好地了解影響LCs溶解度及其聚集傾向的因素，也有一些研究其生物物理性質的探索，但是仍沒有得出明確的結論。為了實現這一目標，創建一個包含LCs生物物理特性及其序列的數據庫必不可少。
本期推送我們給大家介紹一篇法國巴斯德研究所生物部質譜團隊發表在Analytical Chemistry上的文章De Novo Sequencing of Antibody Light Chain Proteoforms from Patients with Multiple Myeloma。作者結合自下而上和自上而下的蛋白質組學方法，建立了一種新的從頭測序工作流程用于患者體內LCs的鑒定，無需數據庫搜索。PEAKS Studio用于多肽的從頭測序解析，然后基于ALPS平臺(詳見特別提示)進一步將這些肽段組裝成全長LCs序列。自上而下的蛋白質組學提供了蛋白質形態的完整分子質量，并可以精確測定所有發生翻譯后修飾的氨基酸。然后，將該工作流用于從10例多發性骨髓瘤患者的尿液中提取的LCs的完全從頭測序。
作者首先對P15樣本的LCs進行了完整分子量的測定，還原烷基化前后，檢測到的實際分子量分別為 23576.60 Da 和 23746.74 Da。然后，使用四種不同的酶(trypsin,Lys-C, pepsin, and Nepenthes digestive fluid)分別進行酶切，優化了LC - MS/MS方法，生成的數據用PEAKS進行分析，得到從頭測序的肽段，然后用ALPS[3]將這些肽段進行組裝。最終得到兩條組裝的序列，其中一條序列的理論分子量為23746.60 Da，與先前測定的結果一致，因此被選定為候選序列。
圖1 完整分子量測定（A:15K，B-C:120 K）
圖3 P15-Trypsin搜庫匹配
本期推送我們給大家介紹一篇法國巴斯德研究所生物部質譜團隊發表在Analytical Chemistry上的文章De Novo Sequencing of Antibody Light Chain Proteoforms from Patients with Multiple Myeloma。作者結合自下而上和自上而下的蛋白質組學方法，建立了一種新的從頭測序工作流程用于患者體內LCs的鑒定，無需數據庫搜索。PEAKS Studio用于多肽的從頭測序解析，然后基于ALPS平臺(詳見特別提示)進一步將這些肽段組裝成全長LCs序列。自上而下的蛋白質組學提供了蛋白質形態的完整分子質量，并可以精確測定所有發生翻譯后修飾的氨基酸。然后，將該工作流用于從10例多發性骨髓瘤患者的尿液中提取的LCs的完全從頭測序。
作者首先對P15樣本的LCs進行了完整分子量的測定，還原烷基化前后，檢測到的實際分子量分別為 23576.60 Da 和 23746.74 Da。然后，使用四種不同的酶(trypsin,Lys-C, pepsin, and Nepenthes digestive fluid)分別進行酶切，優化了LC - MS/MS方法，生成的數據用PEAKS進行分析，得到從頭測序的肽段，然后用ALPS[3]將這些肽段進行組裝。最終得到兩條組裝的序列，其中一條序列的理論分子量為23746.60 Da，與先前測定的結果一致，因此被選定為候選序列。
圖1 完整分子量測定（A:15K，B-C:120 K）
接下來，作者又結合多種碎裂方式(CID、HCD、EThcd、UVPD)，進行了自上而下(TPD)的LCs蛋白表征，達到89%的氨基酸碎片覆蓋率(圖2)。為了確認沒有覆蓋到的區域，用Trypsin酶切的數據對Uniprot human蛋白數據庫+上述組裝出來的候選LC序列進行搜庫分析，結果顯示P15樣本能達到100%序列覆蓋(圖3)。另外，為了確認二硫鍵和半胱氨酸化的分布，對P15樣本進行了非還原的酶切實驗，結果發現二硫鍵主要發生在C23-C88和C134-C194之間，半胱氨酸化主要發生在C端。最后，為了區分I和L，又對包含I和L的多肽進行了EThcd和HCD分析，最終在P15中正確歸屬20/24個I/L的位點，其余4個通過序列同源性完成歸屬。
圖2 Top-down分析
圖3 P15-Trypsin搜庫匹配
最后，作者將上述實驗方案應用到其他臨床樣本中，根據結果序列的同源性與共同特征，可分為四組進行討論。P6、P7、P18和P20這些樣品與P15基本一致，并且可以以相同的方式通過從頭測序組裝出來(表1)。這些樣品含有單個κ LC，其以單體和二聚體形式存在。P8和P19序列同源性為88.4%，每個樣本均含有兩種變體。P8的第一種蛋白質構型(P8A)在C端發生了半胱氨酸化，第二種蛋白質構型(P8B)可能被輔酶M(C2H6O3S2)修飾，這是一種常被用作化療輔助劑的小分子。P19的兩種蛋白質形式均在C端發生半胱氨酸化，其中P19B的S160處存在一個低聚糖HexNAc(1)dHex(1)修飾。P5包含兩種不同的κ蛋白形式，它們具有不同的氨基酸序列，C端具有5個半胱氨酸、2個二硫鍵和一個半胱氨酸化的共同模式，但在LC的可變部分存在13個殘基的差異。P1和P13均只含有單一的λ LC蛋白形式。
表1 所有臨床樣本的LCs測序結果
總結
該工作流程基于bottom up和top down方法的結合，以及使用適當的商業軟件工具，首次在序列、PTMs和單體或二聚體形式的存在方面表征LCs的高可變性，能夠識別出與特定患者的特定治療方法相關的意外修飾，同一患者出現不同的LC序列表明存在多個漿細胞克隆或指向不可預測的成熟過程。該研究的總體目標是確定影響這些LC聚集傾向并導致疾病的主要因素，以了解聚合過程并能夠在將來防止聚集的發生。
文獻原文鏈接
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.1c01955?fig=fig3&ref=pdf
特別提示
文中提到的ALPS是由PEAKS軟件母公司Bioinformatics Solutions Inc.于2016年發表的首個全自動蛋白序列組裝平臺，現已成為成熟的商業化軟件—PEAKS AB，專門用于未知抗體與蛋白藥物的整體序列組裝、糖基化位點鑒定與完整分子量解卷積分析，如需對PEAKS系列軟件進一步了解，請提交您的信息，我們將在2個工作日內與您聯系。
參考文獻
[1] Bakkus, M. H.; Heirman, C.; Van Riet, I.; Van Camp, B.;Thielemans, K. Blood 1992, 80, 2326−2335.
[2] Chapman, M. A.; Lawrence, M. S.; Ahmann, G.J.; Adli, M.; Golub, T. R., et al. Nature 2011,471, 467−472.
[3] Tran, N. H.; Rahman, M. Z.; He, L.; Xin, L.; Shan, B.; Li, M. Sci.Rep. 2016, 6, 31730.
作為生物信息學的領軍企業，BSI專注于蛋白質組學和生物藥領域，通過機器學習和先進算法提供世界領先的質譜數據分析軟件和蛋白質組學服務解決方案，以推進生物學研究和藥物發現。我們通過基于AI的計算方案，為您提供對蛋白質組學、基因組學和醫學的卓越洞見。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數千家學術和工業用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽組發現服務和抗體綜合表征服務等。聯系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
該工作流程基于bottom up和top down方法的結合，以及使用適當的商業軟件工具，首次在序列、PTMs和單體或二聚體形式的存在方面表征LCs的高可變性，能夠識別出與特定患者的特定治療方法相關的意外修飾，同一患者出現不同的LC序列表明存在多個漿細胞克隆或指向不可預測的成熟過程。該研究的總體目標是確定影響這些LC聚集傾向并導致疾病的主要因素，以了解聚合過程并能夠在將來防止聚集的發生。
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https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.1c01955?fig=fig3&ref=pdf
特別提示
文中提到的ALPS是由PEAKS軟件母公司Bioinformatics Solutions Inc.于2016年發表的首個全自動蛋白序列組裝平臺，現已成為成熟的商業化軟件—PEAKS AB，專門用于未知抗體與蛋白藥物的整體序列組裝、糖基化位點鑒定與完整分子量解卷積分析，如需對PEAKS系列軟件進一步了解，請提交您的信息，我們將在2個工作日內與您聯系。
參考文獻
[1] Bakkus, M. H.; Heirman, C.; Van Riet, I.; Van Camp, B.;Thielemans, K. Blood 1992, 80, 2326−2335.
[2] Chapman, M. A.; Lawrence, M. S.; Ahmann, G.J.; Adli, M.; Golub, T. R., et al. Nature 2011,471, 467−472.
[3] Tran, N. H.; Rahman, M. Z.; He, L.; Xin, L.; Shan, B.; Li, M. Sci.Rep. 2016, 6, 31730.
作為生物信息學的領軍企業，BSI專注于蛋白質組學和生物藥領域，通過機器學習和先進算法提供世界領先的質譜數據分析軟件和蛋白質組學服務解決方案，以推進生物學研究和藥物發現。我們通過基于AI的計算方案，為您提供對蛋白質組學、基因組學和醫學的卓越洞見。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數千家學術和工業用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽組發現服務和抗體綜合表征服務等。聯系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
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