一種整合DDA-PRM-dMRM的新方案實現高風險HCPs的定性定量分析
宿主細胞蛋白（HCPs）是生物治療藥物中與工藝相關的關鍵雜質，會影響藥物的穩定性和安全性。治療性蛋白與殘留HCPs成分的動態范圍極大，往往大于5個數量級，導致高風險HCPs檢測更加困難。LC-MS/MS檢測可以突破傳統免疫分析方法在靈敏度和特異性方面的局限性，已成為有效檢測和定量HCPs的關鍵工具，可指導下游純化工藝并監測HCPs清除效果。
2025年6月，中國醫學科學院北京協和醫學院的張金蘭教授課題組在Journal of Proteome Research發表了一套新的HCPs監測方法[1]，首先通過數據依賴采集（DDA）構建包含所有潛在HCPs的CHO細胞蛋白庫，然后對38種已報道的高風險HCPs進行了平行反應監測（PRM）和多重反應監測（MRM）交叉驗證，最終篩選出28種高風險HCPs及其特異性肽段和離子對信息。下一步建立并驗證了一種新的動態MRM（dMRM）方法，可以同時定量28種高風險HCPs。最后，應用上述策略分析了五個純化的單克隆抗體制備工藝樣品，通過DDA方法對未知HCPs進行全面分析，使用dMRM方法對28種已知高風險HCPs進行快速定量�？傮w而言，該策略能夠對已知和未知HCPs進行全面分析，指導生物制藥工藝的優化。本研究中DDA數據分析使用PEAKS Studio完成。
潛在宿主細胞蛋白庫構建
許多研究傾向基于數據非依賴采集（DIA）的方法來檢測HCPs，這樣可以減少低豐度信號的缺失，提高蛋白質組的覆蓋深度，但DIA的譜圖處理更加復雜，也容易受到復雜基質的信號干擾。本研究中，作者選擇了以DDA的方式構建HCPs蛋白質譜圖庫，基于該庫直接生成PRM/MRM離子對列表，可確保工藝開發階段方法的一致性。為確保對低豐度HCPs鑒定的全面性，作者對中國倉鼠卵巢（CHO）細胞提取的全蛋白溶液，采用了兩種不同的酶切方案：自制溶液和EasyPep MS試劑盒。結果顯示，EasyPep MS試劑盒處理的樣本蛋白鑒定更多。最終采用EasyPep MS試劑盒、400ng質譜進樣和150min梯度的方法進行后續實驗（Figure S1）。最終構建了一個包含6863個蛋白質、143166條多肽的譜圖庫，超過了目前已報道的CHO細胞蛋白庫。
高風險HCPs預測及驗證
在上述已建立的譜圖庫基礎上，作者又整合了NIST CHO多肽譜圖庫，然后利用整合后的譜圖庫，在已報道的38種高風險HCPs中，預測出了36種蛋白的444 peptides、5787 precursors和3522 transitions。通過PRM和MRM對這36種蛋白的特異性肽段進行了交叉驗證，有效消除了背景和非特異性肽段的干擾，排除了在MRM和PRM數據中譜峰均較差的8個蛋白，最終驗證了28種高風險HCPs的47條unique peptides和141個 transitions（Table 2）。Figure 2展示了六類高風險HCPs中代表性肽段的b/y離子碎裂譜圖、PRM和MRM色譜圖。這些transitions在PRM模式下具有高特異性，在MRM模式下具有出色的靈敏度和重現性，確保了定量的可靠性。
方法驗證
在生物制藥下游生產中，去除殘留的HCPs對產品質量至關重要。大多數單克隆抗體（mAb）生產工藝需要將雜質降低至100ppm以下，不過某些具有免疫原性或生物活性的HCPs在低于這個標準的情況下仍然影響產品的安全性和有效性。因此，作者在0.1-100nmol的范圍內對標準曲線進行了驗證（等同于50kDa的HCP在10g/L的mAB溶液中的含量在0.5-500ppm 之間）。首先篩選出28個高風險HCPs中響應最高的28條peptides，并使用外源性合成的同位素多肽LLIYGATNLADGVPSR*(13C615N4-R)作為內標（IS）。為了模擬實際樣品狀態并將干擾降至最低，選擇以人血漿來源的IgG作為基質，然后配置至少6個濃度梯度繪制標準曲線，得到的相關系數R2超過0.98。結果如Table S3所示，10種肽具有良好的線性（0.1 – 100nmol/L），21種肽的定量下限低于1 nmol/L），25種肽的上限達到100 nmol/L。除了LVQAQYWHDPIK的線性范圍較窄外，所有肽均涵蓋了下游純化過程中典型的HCP濃度范圍。此外，作者又在實際條件下對穩定性進行了驗證，包括在室溫（RT）下24小時的短期穩定性、凍融穩定性（從−80°C到室溫的三個凍融循環）以及在4°C下7天的長期穩定性。所有肽在相對誤差（RE）和相對標準偏差（RSD）±15.0%范圍內保持穩定。所有驗證結果均符合中國藥典對生物樣品的標準，這充分證明了該方法對28種高風險宿主細胞蛋白進行精確定量的穩健性，適用于生物制藥過程監測和質量控制。
方法應用
作者將上述方法應用于VEGF單克隆抗體下游純化的5個樣本，檢測其中的28種已知的高風險HCPs。DDA模式在細胞培養液（HCCF）中鑒定到1533種HCPs，在純化后的原料藥中鑒定到38種（Figure 4）。此外，DDA方法鑒定出了一些未被dMRM覆蓋的高風險HCP（如G3GTT2和A4URF0），為全面表征HCP提供了補充信息，并證明了其在監測未知高風險HCP方面的關鍵價值。蛋白A親和層析和親和沉淀過濾（ADF）的去除效率分別達到74%和91%，表明它們在清除HCP方面的有效性。陽離子交換層析（CEX）階段沒有顯著變化。值得注意的是，一些在HCCF中未檢測到的HCP在下游純化過程中被檢測到，這可能是因為基質干擾減少增強了低豐度分子的信號響應。在最終藥物中，仍檢測到三種低ppm水平的高風險HCPs：G3IIB1、G3I6T1和G3H8 V5。它們可能導致聚山梨酯和藥物降解，甚至增加免疫原性風險。盡管這三種HCPs在蛋白A親和層析后顯著減少，但在后續步驟中其清除率趨于平穩，這揭示了當前純化流程中的選擇性局限性。
總結
該研究整合了 DDA（全面分析已知和未知HCPs）、PRM（驗證特異性）和 dMRM（快速定量已知高風險 HCPs）的不同方法，實現了HCPs的全面分析，為生物制藥過程中HCPs的監測提供了高效、全面的解決方案，助力優化純化工藝、提升藥物質量可控性，符合QbD理念。但目前僅基于 CHO-K1 細胞系，可能無法覆蓋其他 CHO 亞型或變異株的 HCPs，未來可擴展至其他宿主細胞系或微生物表達系統，結合人工智能和深度學習，擴展低豐度 HCPs的特征譜圖數據，建立HCP譜圖庫共享平臺。
文獻
1. A Novel Strategy to Rapidly Profile and Quantify High-Risk Host Cell Proteins Using Integrated DDA-PRM-dMRM Mode. Xuan Xu, Lan Wang, Gang Wu, Shengyuan Xu, Yang Li, Ning Sheng, and Jinlan Zhang Journal of Proteome Research 2025 24 (8), 4259-4269, DOI: 10.1021/acs.jproteome.5c00369
作為生物信息學的領軍企業，BSI專注于蛋白質組學和生物藥領域，通過機器學習和先進算法提供世界領先的質譜數據分析軟件和蛋白質組學服務解決方案，以推進生物學研究和藥物發現。我們通過基于AI的計算方案，為您提供對蛋白質組學、基因組學和醫學的卓越洞見。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數千家學術和工業用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，DeepImmu®️ 免疫肽組發現服務和抗體綜合表征服務等。聯系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
2025年6月，中國醫學科學院北京協和醫學院的張金蘭教授課題組在Journal of Proteome Research發表了一套新的HCPs監測方法[1]，首先通過數據依賴采集（DDA）構建包含所有潛在HCPs的CHO細胞蛋白庫，然后對38種已報道的高風險HCPs進行了平行反應監測（PRM）和多重反應監測（MRM）交叉驗證，最終篩選出28種高風險HCPs及其特異性肽段和離子對信息。下一步建立并驗證了一種新的動態MRM（dMRM）方法，可以同時定量28種高風險HCPs。最后，應用上述策略分析了五個純化的單克隆抗體制備工藝樣品，通過DDA方法對未知HCPs進行全面分析，使用dMRM方法對28種已知高風險HCPs進行快速定量�？傮w而言，該策略能夠對已知和未知HCPs進行全面分析，指導生物制藥工藝的優化。本研究中DDA數據分析使用PEAKS Studio完成。
潛在宿主細胞蛋白庫構建
許多研究傾向基于數據非依賴采集（DIA）的方法來檢測HCPs，這樣可以減少低豐度信號的缺失，提高蛋白質組的覆蓋深度，但DIA的譜圖處理更加復雜，也容易受到復雜基質的信號干擾。本研究中，作者選擇了以DDA的方式構建HCPs蛋白質譜圖庫，基于該庫直接生成PRM/MRM離子對列表，可確保工藝開發階段方法的一致性。為確保對低豐度HCPs鑒定的全面性，作者對中國倉鼠卵巢（CHO）細胞提取的全蛋白溶液，采用了兩種不同的酶切方案：自制溶液和EasyPep MS試劑盒。結果顯示，EasyPep MS試劑盒處理的樣本蛋白鑒定更多。最終采用EasyPep MS試劑盒、400ng質譜進樣和150min梯度的方法進行后續實驗（Figure S1）。最終構建了一個包含6863個蛋白質、143166條多肽的譜圖庫，超過了目前已報道的CHO細胞蛋白庫。
高風險HCPs預測及驗證
在上述已建立的譜圖庫基礎上，作者又整合了NIST CHO多肽譜圖庫，然后利用整合后的譜圖庫，在已報道的38種高風險HCPs中，預測出了36種蛋白的444 peptides、5787 precursors和3522 transitions。通過PRM和MRM對這36種蛋白的特異性肽段進行了交叉驗證，有效消除了背景和非特異性肽段的干擾，排除了在MRM和PRM數據中譜峰均較差的8個蛋白，最終驗證了28種高風險HCPs的47條unique peptides和141個 transitions（Table 2）。Figure 2展示了六類高風險HCPs中代表性肽段的b/y離子碎裂譜圖、PRM和MRM色譜圖。這些transitions在PRM模式下具有高特異性，在MRM模式下具有出色的靈敏度和重現性，確保了定量的可靠性。
方法驗證
在生物制藥下游生產中，去除殘留的HCPs對產品質量至關重要。大多數單克隆抗體（mAb）生產工藝需要將雜質降低至100ppm以下，不過某些具有免疫原性或生物活性的HCPs在低于這個標準的情況下仍然影響產品的安全性和有效性。因此，作者在0.1-100nmol的范圍內對標準曲線進行了驗證（等同于50kDa的HCP在10g/L的mAB溶液中的含量在0.5-500ppm 之間）。首先篩選出28個高風險HCPs中響應最高的28條peptides，并使用外源性合成的同位素多肽LLIYGATNLADGVPSR*(13C615N4-R)作為內標（IS）。為了模擬實際樣品狀態并將干擾降至最低，選擇以人血漿來源的IgG作為基質，然后配置至少6個濃度梯度繪制標準曲線，得到的相關系數R2超過0.98。結果如Table S3所示，10種肽具有良好的線性（0.1 – 100nmol/L），21種肽的定量下限低于1 nmol/L），25種肽的上限達到100 nmol/L。除了LVQAQYWHDPIK的線性范圍較窄外，所有肽均涵蓋了下游純化過程中典型的HCP濃度范圍。此外，作者又在實際條件下對穩定性進行了驗證，包括在室溫（RT）下24小時的短期穩定性、凍融穩定性（從−80°C到室溫的三個凍融循環）以及在4°C下7天的長期穩定性。所有肽在相對誤差（RE）和相對標準偏差（RSD）±15.0%范圍內保持穩定。所有驗證結果均符合中國藥典對生物樣品的標準，這充分證明了該方法對28種高風險宿主細胞蛋白進行精確定量的穩健性，適用于生物制藥過程監測和質量控制。
方法應用
作者將上述方法應用于VEGF單克隆抗體下游純化的5個樣本，檢測其中的28種已知的高風險HCPs。DDA模式在細胞培養液（HCCF）中鑒定到1533種HCPs，在純化后的原料藥中鑒定到38種（Figure 4）。此外，DDA方法鑒定出了一些未被dMRM覆蓋的高風險HCP（如G3GTT2和A4URF0），為全面表征HCP提供了補充信息，并證明了其在監測未知高風險HCP方面的關鍵價值。蛋白A親和層析和親和沉淀過濾（ADF）的去除效率分別達到74%和91%，表明它們在清除HCP方面的有效性。陽離子交換層析（CEX）階段沒有顯著變化。值得注意的是，一些在HCCF中未檢測到的HCP在下游純化過程中被檢測到，這可能是因為基質干擾減少增強了低豐度分子的信號響應。在最終藥物中，仍檢測到三種低ppm水平的高風險HCPs：G3IIB1、G3I6T1和G3H8 V5。它們可能導致聚山梨酯和藥物降解，甚至增加免疫原性風險。盡管這三種HCPs在蛋白A親和層析后顯著減少，但在后續步驟中其清除率趨于平穩，這揭示了當前純化流程中的選擇性局限性。
總結
該研究整合了 DDA（全面分析已知和未知HCPs）、PRM（驗證特異性）和 dMRM（快速定量已知高風險 HCPs）的不同方法，實現了HCPs的全面分析，為生物制藥過程中HCPs的監測提供了高效、全面的解決方案，助力優化純化工藝、提升藥物質量可控性，符合QbD理念。但目前僅基于 CHO-K1 細胞系，可能無法覆蓋其他 CHO 亞型或變異株的 HCPs，未來可擴展至其他宿主細胞系或微生物表達系統，結合人工智能和深度學習，擴展低豐度 HCPs的特征譜圖數據，建立HCP譜圖庫共享平臺。
文獻
1. A Novel Strategy to Rapidly Profile and Quantify High-Risk Host Cell Proteins Using Integrated DDA-PRM-dMRM Mode. Xuan Xu, Lan Wang, Gang Wu, Shengyuan Xu, Yang Li, Ning Sheng, and Jinlan Zhang Journal of Proteome Research 2025 24 (8), 4259-4269, DOI: 10.1021/acs.jproteome.5c00369
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