多發(fā)性骨髓瘤患者樣本中抗體輕鏈的從頭測(cè)序方法
多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種以異常B細(xì)胞克隆擴(kuò)增為特征的漿細(xì)胞惡性腫瘤[1,2]。B細(xì)胞在骨髓中積累，除了完整免疫球蛋白外，還分泌大量單克隆輕鏈(LCs)，并且15%的MM患者只產(chǎn)生LCs。25 kDa LCs蛋白通常由腎臟排泄或降解，但隨著單克隆數(shù)量異常曾高和腎臟清除率降低，可誘導(dǎo)多種LC聚集體沉積在腎臟的細(xì)胞外基質(zhì)中，從而導(dǎo)致各種疾病。目前，無(wú)法預(yù)測(cè)LCs患者血液中發(fā)現(xiàn)的特定單克隆LCs的體內(nèi)聚集行為。為了更好地了解影響LCs溶解度及其聚集傾向的因素，也有一些研究其生物物理性質(zhì)的探索，但是仍沒(méi)有得出明確的結(jié)論。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，創(chuàng)建一個(gè)包含LCs生物物理特性及其序列的數(shù)據(jù)庫(kù)必不可少。
本期推送我們給大家介紹一篇法國(guó)巴斯德研究所生物部質(zhì)譜團(tuán)隊(duì)發(fā)表在Analytical Chemistry上的文章De Novo Sequencing of Antibody Light Chain Proteoforms from Patients with Multiple Myeloma。作者結(jié)合自下而上和自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，建立了一種新的從頭測(cè)序工作流程用于患者體內(nèi)LCs的鑒定，無(wú)需數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。PEAKS Studio用于多肽的從頭測(cè)序解析，然后基于ALPS平臺(tái)(詳見(jiàn)特別提示)進(jìn)一步將這些肽段組裝成全長(zhǎng)LCs序列。自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)提供了蛋白質(zhì)形態(tài)的完整分子質(zhì)量，并可以精確測(cè)定所有發(fā)生翻譯后修飾的氨基酸。然后，將該工作流用于從10例多發(fā)性骨髓瘤患者的尿液中提取的LCs的完全從頭測(cè)序。
作者首先對(duì)P15樣本的LCs進(jìn)行了完整分子量的測(cè)定，還原烷基化前后，檢測(cè)到的實(shí)際分子量分別為 23576.60 Da 和 23746.74 Da。然后，使用四種不同的酶(trypsin,Lys-C, pepsin, and Nepenthes digestive fluid)分別進(jìn)行酶切，優(yōu)化了LC - MS/MS方法，生成的數(shù)據(jù)用PEAKS進(jìn)行分析，得到從頭測(cè)序的肽段，然后用ALPS[3]將這些肽段進(jìn)行組裝。最終得到兩條組裝的序列，其中一條序列的理論分子量為23746.60 Da，與先前測(cè)定的結(jié)果一致，因此被選定為候選序列。
圖1 完整分子量測(cè)定（A:15K，B-C:120 K）
圖3 P15-Trypsin搜庫(kù)匹配
本期推送我們給大家介紹一篇法國(guó)巴斯德研究所生物部質(zhì)譜團(tuán)隊(duì)發(fā)表在Analytical Chemistry上的文章De Novo Sequencing of Antibody Light Chain Proteoforms from Patients with Multiple Myeloma。作者結(jié)合自下而上和自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，建立了一種新的從頭測(cè)序工作流程用于患者體內(nèi)LCs的鑒定，無(wú)需數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。PEAKS Studio用于多肽的從頭測(cè)序解析，然后基于ALPS平臺(tái)(詳見(jiàn)特別提示)進(jìn)一步將這些肽段組裝成全長(zhǎng)LCs序列。自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)提供了蛋白質(zhì)形態(tài)的完整分子質(zhì)量，并可以精確測(cè)定所有發(fā)生翻譯后修飾的氨基酸。然后，將該工作流用于從10例多發(fā)性骨髓瘤患者的尿液中提取的LCs的完全從頭測(cè)序。
作者首先對(duì)P15樣本的LCs進(jìn)行了完整分子量的測(cè)定，還原烷基化前后，檢測(cè)到的實(shí)際分子量分別為 23576.60 Da 和 23746.74 Da。然后，使用四種不同的酶(trypsin,Lys-C, pepsin, and Nepenthes digestive fluid)分別進(jìn)行酶切，優(yōu)化了LC - MS/MS方法，生成的數(shù)據(jù)用PEAKS進(jìn)行分析，得到從頭測(cè)序的肽段，然后用ALPS[3]將這些肽段進(jìn)行組裝。最終得到兩條組裝的序列，其中一條序列的理論分子量為23746.60 Da，與先前測(cè)定的結(jié)果一致，因此被選定為候選序列。
圖1 完整分子量測(cè)定（A:15K，B-C:120 K）
接下來(lái)，作者又結(jié)合多種碎裂方式(CID、HCD、EThcd、UVPD)，進(jìn)行了自上而下(TPD)的LCs蛋白表征，達(dá)到89%的氨基酸碎片覆蓋率(圖2)。為了確認(rèn)沒(méi)有覆蓋到的區(qū)域，用Trypsin酶切的數(shù)據(jù)對(duì)Uniprot human蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)+上述組裝出來(lái)的候選LC序列進(jìn)行搜庫(kù)分析，結(jié)果顯示P15樣本能達(dá)到100%序列覆蓋(圖3)。另外，為了確認(rèn)二硫鍵和半胱氨酸化的分布，對(duì)P15樣本進(jìn)行了非還原的酶切實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二硫鍵主要發(fā)生在C23-C88和C134-C194之間，半胱氨酸化主要發(fā)生在C端。最后，為了區(qū)分I和L，又對(duì)包含I和L的多肽進(jìn)行了EThcd和HCD分析，最終在P15中正確歸屬20/24個(gè)I/L的位點(diǎn)，其余4個(gè)通過(guò)序列同源性完成歸屬。
圖2 Top-down分析
圖3 P15-Trypsin搜庫(kù)匹配
最后，作者將上述實(shí)驗(yàn)方案應(yīng)用到其他臨床樣本中，根據(jù)結(jié)果序列的同源性與共同特征，可分為四組進(jìn)行討論。P6、P7、P18和P20這些樣品與P15基本一致，并且可以以相同的方式通過(guò)從頭測(cè)序組裝出來(lái)(表1)。這些樣品含有單個(gè)κ LC，其以單體和二聚體形式存在。P8和P19序列同源性為88.4%，每個(gè)樣本均含有兩種變體。P8的第一種蛋白質(zhì)構(gòu)型(P8A)在C端發(fā)生了半胱氨酸化，第二種蛋白質(zhì)構(gòu)型(P8B)可能被輔酶M(C2H6O3S2)修飾，這是一種常被用作化療輔助劑的小分子。P19的兩種蛋白質(zhì)形式均在C端發(fā)生半胱氨酸化，其中P19B的S160處存在一個(gè)低聚糖HexNAc(1)dHex(1)修飾。P5包含兩種不同的κ蛋白形式，它們具有不同的氨基酸序列，C端具有5個(gè)半胱氨酸、2個(gè)二硫鍵和一個(gè)半胱氨酸化的共同模式，但在LC的可變部分存在13個(gè)殘基的差異。P1和P13均只含有單一的λ LC蛋白形式。
表1 所有臨床樣本的LCs測(cè)序結(jié)果
總結(jié)
該工作流程基于bottom up和top down方法的結(jié)合，以及使用適當(dāng)?shù)纳虡I(yè)軟件工具，首次在序列、PTMs和單體或二聚體形式的存在方面表征LCs的高可變性，能夠識(shí)別出與特定患者的特定治療方法相關(guān)的意外修飾，同一患者出現(xiàn)不同的LC序列表明存在多個(gè)漿細(xì)胞克隆或指向不可預(yù)測(cè)的成熟過(guò)程。該研究的總體目標(biāo)是確定影響這些LC聚集傾向并導(dǎo)致疾病的主要因素，以了解聚合過(guò)程并能夠在將來(lái)防止聚集的發(fā)生。
文獻(xiàn)原文鏈接
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.1c01955?fig=fig3&ref=pdf
特別提示
文中提到的ALPS是由PEAKS軟件母公司Bioinformatics Solutions Inc.于2016年發(fā)表的首個(gè)全自動(dòng)蛋白序列組裝平臺(tái)，現(xiàn)已成為成熟的商業(yè)化軟件—PEAKS AB，專(zhuān)門(mén)用于未知抗體與蛋白藥物的整體序列組裝、糖基化位點(diǎn)鑒定與完整分子量解卷積分析，如需對(duì)PEAKS系列軟件進(jìn)一步了解，請(qǐng)?zhí)峤荒男畔ⅲ覀儗⒃?個(gè)工作日內(nèi)與您聯(lián)系。
參考文獻(xiàn)
[1] Bakkus, M. H.; Heirman, C.; Van Riet, I.; Van Camp, B.;Thielemans, K. Blood 1992, 80, 2326−2335.
[2] Chapman, M. A.; Lawrence, M. S.; Ahmann, G.J.; Adli, M.; Golub, T. R., et al. Nature 2011,471, 467−472.
[3] Tran, N. H.; Rahman, M. Z.; He, L.; Xin, L.; Shan, B.; Li, M. Sci.Rep. 2016, 6, 31730.
作為生物信息學(xué)的領(lǐng)軍企業(yè)，BSI專(zhuān)注于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物藥領(lǐng)域，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)和先進(jìn)算法提供世界領(lǐng)先的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件和蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)解決方案，以推進(jìn)生物學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)。我們通過(guò)基于AI的計(jì)算方案，為您提供對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)的卓越洞見(jiàn)。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數(shù)千家學(xué)術(shù)和工業(yè)用戶(hù)，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽組發(fā)現(xiàn)服務(wù)和抗體綜合表征服務(wù)等。聯(lián)系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
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文獻(xiàn)原文鏈接
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參考文獻(xiàn)
[1] Bakkus, M. H.; Heirman, C.; Van Riet, I.; Van Camp, B.;Thielemans, K. Blood 1992, 80, 2326−2335.
[2] Chapman, M. A.; Lawrence, M. S.; Ahmann, G.J.; Adli, M.; Golub, T. R., et al. Nature 2011,471, 467−472.
[3] Tran, N. H.; Rahman, M. Z.; He, L.; Xin, L.; Shan, B.; Li, M. Sci.Rep. 2016, 6, 31730.
作為生物信息學(xué)的領(lǐng)軍企業(yè)，BSI專(zhuān)注于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物藥領(lǐng)域，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)和先進(jìn)算法提供世界領(lǐng)先的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件和蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)解決方案，以推進(jìn)生物學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)。我們通過(guò)基于AI的計(jì)算方案，為您提供對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)的卓越洞見(jiàn)。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數(shù)千家學(xué)術(shù)和工業(yè)用戶(hù)，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽組發(fā)現(xiàn)服務(wù)和抗體綜合表征服務(wù)等。聯(lián)系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
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