WGS等技術助力揭示多發性骨髓瘤免疫逃逸介導CAR-T耐藥的遺傳
2025年7月10日，徐州醫科大學牛銘山教授和姚瑤教授團隊合作，在國際血液學頂級期刊《Blood》（IF 23.1/Q1）上發表題為“Genetic and epigenetic mechanisms of GPRC5D loss after anti-GPRC5D CAR T-cell therapy in multiple myeloma”的重磅研究成果。此研究聚焦于多發性骨髓瘤（MM）患者接受靶向GPRC5D CAR-T細胞治療后復發的耐藥機制，利用整合全基因組測序（WGS）和全基因組甲基化測序（WGBS）技術，系統解析了GPRC5D抗原逃逸介導疾病復發的遺傳學（雙等位基因缺失，如純合缺失）與表觀遺傳學（DNA高甲基化）雙重機制，并通過靶基因DNA甲基化測序（Target-BS）技術在臨床前模型中首次驗證了去甲基化藥物（阿扎胞苷）可逆轉GPRC5D表觀遺傳沉默，為克服CAR-T耐藥提供了精準干預新策略。
標題：Genetic and epigenetic mechanisms of GPRC5D loss after anti-GPRC5D CAR T-cell therapy in multiple myeloma（多發性骨髓瘤抗GPRC5D CAR-T細胞治療后GPRC5D逃逸的遺傳學和表觀遺傳學機制）
發表時間：2025-7-10
發表期刊：Blood
影響因子：IF23.1/Q1
技術平臺：WGS、WGBS、Target-BS
作者單位：徐州醫科大學、天津科技大學、美國哈佛醫學院
DOI：10.1182/blood.2024026622
研究納入10例抗GPRC5D CAR-T治療后復發MM患者，對其復發期骨髓瘤細胞樣本進行WGS和WGBS聯合分析，發現80%病人出現GPRC5D抗原逃逸（丟失）或表達顯著降低。其中3例存在顯著GPRC5D雙等位基因失活（純合缺失或調控區域雙等位缺失），而其余7例無基因突變的患者中，5例檢出GPRC5D轉錄調控區域多位點高甲基化。此外，體外實驗證實，多發性骨髓瘤細胞系的GPRC5D表達水平與其調控區域的甲基化水平呈顯著負相關，而阿扎胞苷干預可顯著恢復高甲基化細胞系（KMS11、IM9、RPMI-8226）的GPRC5D mRNA和蛋白表達。本研究不僅揭示了GPRC5D 逃逸和CAR-T治療耐藥的核心機制，更闡明了DNA甲基化動態監測在預測復發和干預中的關鍵價值。
研究方法
患者樣本：納入10例接受抗GPRC5D CAR-T治療后復發的MM患者，收集其復發期骨髓瘤細胞（CD138+）及配對正常細胞。
全基因組測序：對復發期CD138+ MM細胞及配對正常細胞進行WGS，檢測拷貝數變異（CNV）、結構變異（SV）及單核苷酸變異（SNV），重點篩查GPRC5D位點的基因突變。
全基因組甲基化測序：分析全基因組甲基化水平差異，比較復發組MM細胞、未接受GPRC5D治療的對照MM細胞及正常漿細胞的甲基化圖譜，鑒定差異甲基化區域（DMRs）和差異甲基化位點（DMLs），篩選候選基因GPRC5D轉錄調控元件（啟動子、增強子及基因間區）的CpG甲基化水平。
靶基因甲基化測序：靶向GPRC5D調控區域設計靶向捕獲探針，在7種MM細胞系（KMS11、IM9、JJN3、RPMI-8226、KMS12-PE、NCI-H929、MM1S）中進行Target-BS高深度甲基化檢測，驗證特定CpG位點的甲基化狀態和關鍵差異位點，并建立甲基化水平與基因表達的定量關聯模型。
實驗驗證：
（1）接受抗GPRC5D CAR-T治療后復發患者的臨床特征
本研究納入的10例MM復發患者中，中位年齡57.5歲（44-66歲），性別分布均衡。值得注意的是，90%患者存在高危細胞基因突變，80%為R-ISS II/III期，且既往接受過多線治療（中位3.5線），提示該隊列代表了臨床上難治程度較高的MM人群。4例患者曾接受自體造血干細胞移植，1例患者（P10）在接受抗GPRC5D CAR-T前已接受抗BCMA CAR-T序貫治療并進展為漿細胞白血病伴髓外病變（EMD）。CAR-T治療后，所有患者均達到完全緩解（CR）或更好療效，中位達最佳緩解時間為2.5個月，但中位無進展生存期（PFS）僅15.9個月（3-26.5個月），凸顯復發問題的嚴峻性。免疫學監測顯示，8例患者復發時GPRC5D表達完全陰性，2例呈GPRC5D+/-混合表達但以陰性細胞為主，提示抗原陰性逃逸是抗GPRC5D CAR-T治療后復發的主導模式。這一特征顯著區別于抗BCMA CAR-T治療后常見的抗原陽性復發模式，為后續機制探索指明了方向。
（2）抗GPRC5D CAR-T治療后GPRC5D基因的雙等位缺失
患者1為女性MM復發患者，在接受抗GPRC5D CAR-T治療后18個月復發，骨髓漿細胞浸潤達24%。WGS分析揭示其染色體12p區域存在264 kb雜合缺失和22 kb純合缺失，完全覆蓋GPRC5D基因編碼區，導致雙等位基因失活。qPCR驗證實驗顯示復發樣本中同時檢出雜合和純合缺失拷貝（基線樣本均陰性），證實該缺失為治療后獲得性克隆選擇或治療前極低頻克隆擴增所致。IHC染色顯示，GPRC5D在基線高表達，復發后完全缺失，而CD138表達保持穩定，驗證其抗原逃逸的特異性。此案例首次在GPRC5D CAR-T背景下證實純合缺失是抗原逃逸的主要機制，與BCMA CAR-T耐藥機制高度相似，提示不同靶點CAR-T治療面臨共同的基因突變逃逸風險。
（3）CAR-T治療后GPRC5D調控區域的純合缺失
患者6為復雜性核型κ輕鏈MM，GPRC5D CAR-T治療后13.9個月復發并進展為漿細胞白血病。WGS測序分析揭示其12號染色體上三個缺失片段：13.1 Mb雜合缺失、12.7 Mb雜合缺失和68.2 kb純合缺失。qPCR證實缺失斷點僅見于復發樣本，且純合缺失覆蓋GPRC5D啟動子及增強子區域，導致轉錄徹底沉默。RNA-seq未檢出缺失exon1的替代轉錄本，證實該缺失的功能破壞性。IHC顯示復發樣本中GPRC5D陰性細胞占主導，但仍有36.7%細胞保留GPRC5D表達，與qPCR評估的亞克隆比例高度吻合。表明調控區域缺失可通過破壞轉錄啟動導致抗原免疫逃逸，僅需小片段雙等位缺失即可實現抗原沉默，且可與其他亞克隆的雜合缺失共存，形成復雜的克隆異質性圖譜。該機制在CAR-T領域屬首次系統證實。
（4）CAR免疫風險導致BCMA與GPRC5D雙重丟失
患者10序貫接受抗BCMA CAR-T（4個月后復發）和抗GPRC5D CAR-T治療（3個月后再次復發），該IgG-κ型MM女性經7線治療后進展為漿細胞白血病伴腹部EMD。復發樣本的WGS分析揭示16號染色體存在1.02 Mb雜合缺失和5個局灶性純合缺失，導致TNFRSF17（BCMA編碼基因）雙等位失活；12號染色體則存在13.3 Mb雜合缺失和3個局灶性純合缺失，導致GPRC5D雙等位失活。qPCR驗證至少5個TNFRSF17和3個GPRC5D純合缺失斷點，提示基因組不穩定性驅動下多克隆并行演化。該患者經多線治療后演變為至少15條染色體的復雜核型，證實患者基因組不穩定性容易介導多靶點抗原丟失。流式與IHC實驗結果顯示，治療前BCMA與GPRC5D雙高表達，復發后雙抗原均陰性，導致CAR-T策略失效。此案例分析結果表明，對于基因組不穩定的高�；颊�，單靶點序貫治療可能加速多抗原逃逸，多靶點CAR-T（如BCMA/GPRC5D雙特異CAR）或聯合去甲基化干預可能是更優選擇。
（5）CAR-T治療后復發MM細胞中GPRC5D的表觀遺傳沉默
在7例WGS未檢出GPRC5D基因突變的復發患者中，WGBS分析結果顯示5例MM復發患者存在GPRC5D調控區域高甲基化，靶向甲基化測序（Target-BS）分析結果顯示多個CpG位點甲基化水平與GPRC5D表達負相關，揭示表觀遺傳重編程是主要逃逸機制。具體而言，復發MM細胞的全基因組甲基化水平相較于正常漿細胞呈顯著低甲基化（MM特征），但相較于未接受GPRC5D治療的對照MM細胞則表現為高甲基化，WGBS共鑒定出735.8萬高甲基化DMLs和72萬高甲基化DMRs，提示CAR-T治療誘導特異性甲基化重編程。靶向GPRC5D位點的Target-BS測序分析揭示，5例復發患者在轉錄調控元件（啟動子、增強子及內含子-外顯子邊界）呈現多位點高甲基化，而7例對照MM樣本該區域均維持低甲基化狀態。值得注意的是，兩例正常漿細胞對照（GPRC5D陽性率僅10.1%和12.9%）也在該區域顯示高甲基化，提示GPRC5D甲基化水平與表達呈負相關。
細胞系實驗中，阿扎胞苷處理可誘導高甲基化細胞系（如RPMI-8226）的GPRC5D mRNA和蛋白表達上調，證明DNA高甲基化是獨立的抗原沉默機制。
(C) IGV展示GPRC5D位點的DNA甲基化圖譜。
(B) 多發性骨髓瘤細胞系中GPRC5D mRNA表達的qPCR分析。
(C) GPRC5D mRNA水平倍數變化與其調控區差異甲基化CpG位點平均甲基化水平之間的相關性分析。
(D) 阿扎胞苷處理誘導GPRC5D mRNA表達增加。
(E) 流式細胞術檢測顯示，RPMI-8226細胞經72小時阿扎胞苷處理后GPRC5D蛋白表達升高。
結論和啟示
本研究證實GPRC5D免疫逃逸是CAR-T耐藥的主要機制，且存在表觀遺傳沉默與遺傳缺失。研究者發現去甲基化藥物在細胞系中可部分逆轉沉默，但臨床轉化需進一步優化給藥策略�？傊邢騁PRC5D的聯合療法（如CAR-T+去甲基化藥物）可能是克服耐藥的新方向，未來研究需動態監測甲基化水平，實現耐藥克隆的早期干預。
易基因的TBS技術是本研究從發現到驗證的關鍵工具。TBS通過靶向捕獲實現了：
超高深度：在GPRC5D調控區達到500×以上測序深度，精確檢測單個CpG位點甲基化水平，分辨低豐度耐藥亞克隆（<5%）。
成本效益：適合大規模樣本隊列（如本研究7個細胞系+多例臨床樣本）的快速驗證，為WGBS發現的重要DMRs提供經濟可行的臨床轉化路徑。
功能關聯：TBS數據與qPCR表達數據精準配對，建立甲基化-表達回歸模型，篩選出調控效能最強的CpG位點，為后續開發甲基化特異性引物用于MRD監測提供靶點。
參考文獻：
Ma S, Xia J, Zhang M, Li W, Xiao M, Sha Y, Wang W, Zhou J, Wang Y, Qi K, Fu C, Sun Z, Zhou D, Sun Q, Qiu T, Yan Z, Zhu F, Chen W, Cheng H, Sang W, Cao J, Li D, Li ZZ, Fulciniti M, Yao Y, Xu K, Niu M. Genetic and epigenetic mechanisms of GPRC5D loss after anti-GPRC5D CAR T-cell therapy in multiple myeloma. Blood. 2025 Mar 16. doi: 10.1182/blood.2024026622.
標題：Genetic and epigenetic mechanisms of GPRC5D loss after anti-GPRC5D CAR T-cell therapy in multiple myeloma（多發性骨髓瘤抗GPRC5D CAR-T細胞治療后GPRC5D逃逸的遺傳學和表觀遺傳學機制）
發表時間：2025-7-10
發表期刊：Blood
影響因子：IF23.1/Q1
技術平臺：WGS、WGBS、Target-BS
作者單位：徐州醫科大學、天津科技大學、美國哈佛醫學院
DOI：10.1182/blood.2024026622
研究納入10例抗GPRC5D CAR-T治療后復發MM患者，對其復發期骨髓瘤細胞樣本進行WGS和WGBS聯合分析，發現80%病人出現GPRC5D抗原逃逸（丟失）或表達顯著降低。其中3例存在顯著GPRC5D雙等位基因失活（純合缺失或調控區域雙等位缺失），而其余7例無基因突變的患者中，5例檢出GPRC5D轉錄調控區域多位點高甲基化。此外，體外實驗證實，多發性骨髓瘤細胞系的GPRC5D表達水平與其調控區域的甲基化水平呈顯著負相關，而阿扎胞苷干預可顯著恢復高甲基化細胞系（KMS11、IM9、RPMI-8226）的GPRC5D mRNA和蛋白表達。本研究不僅揭示了GPRC5D 逃逸和CAR-T治療耐藥的核心機制，更闡明了DNA甲基化動態監測在預測復發和干預中的關鍵價值。
- 抗原陰性逃逸是多發性骨髓瘤患者接受抗GPRC5D CAR-T細胞治療后復發的關鍵驅動因子。
- GPRC5D純合缺失和高甲基化是靶向抗原逃逸的重要機制。
研究摘要
研究方法
患者樣本：納入10例接受抗GPRC5D CAR-T治療后復發的MM患者，收集其復發期骨髓瘤細胞（CD138+）及配對正常細胞。
全基因組測序：對復發期CD138+ MM細胞及配對正常細胞進行WGS，檢測拷貝數變異（CNV）、結構變異（SV）及單核苷酸變異（SNV），重點篩查GPRC5D位點的基因突變。
全基因組甲基化測序：分析全基因組甲基化水平差異，比較復發組MM細胞、未接受GPRC5D治療的對照MM細胞及正常漿細胞的甲基化圖譜，鑒定差異甲基化區域（DMRs）和差異甲基化位點（DMLs），篩選候選基因GPRC5D轉錄調控元件（啟動子、增強子及基因間區）的CpG甲基化水平。
靶基因甲基化測序：靶向GPRC5D調控區域設計靶向捕獲探針，在7種MM細胞系（KMS11、IM9、JJN3、RPMI-8226、KMS12-PE、NCI-H929、MM1S）中進行Target-BS高深度甲基化檢測，驗證特定CpG位點的甲基化狀態和關鍵差異位點，并建立甲基化水平與基因表達的定量關聯模型。
實驗驗證：
- qPCR：驗證WGS檢出的GPRC5D和TNFRSF17缺失斷點；檢測GPRC5D mRNA表達。
- 流式細胞術：GPRC5D抗體和BCMA抗體檢測抗原陽性率，評估CAR-T治療后抗原表達動態變化。
- 免疫組織化學（IHC）：抗GPRC5D抗體和抗CD138抗體進行染色評估蛋白表達缺失。
- 藥物干預實驗：用1或3μM阿扎胞苷處理高甲基化MM細胞系，評估GPRC5D表達恢復情況。
（1）接受抗GPRC5D CAR-T治療后復發患者的臨床特征
本研究納入的10例MM復發患者中，中位年齡57.5歲（44-66歲），性別分布均衡。值得注意的是，90%患者存在高危細胞基因突變，80%為R-ISS II/III期，且既往接受過多線治療（中位3.5線），提示該隊列代表了臨床上難治程度較高的MM人群。4例患者曾接受自體造血干細胞移植，1例患者（P10）在接受抗GPRC5D CAR-T前已接受抗BCMA CAR-T序貫治療并進展為漿細胞白血病伴髓外病變（EMD）。CAR-T治療后，所有患者均達到完全緩解（CR）或更好療效，中位達最佳緩解時間為2.5個月，但中位無進展生存期（PFS）僅15.9個月（3-26.5個月），凸顯復發問題的嚴峻性。免疫學監測顯示，8例患者復發時GPRC5D表達完全陰性，2例呈GPRC5D+/-混合表達但以陰性細胞為主，提示抗原陰性逃逸是抗GPRC5D CAR-T治療后復發的主導模式。這一特征顯著區別于抗BCMA CAR-T治療后常見的抗原陽性復發模式，為后續機制探索指明了方向。
圖1：分別靶向GPRC5D或BCMA CAR-T細胞治療的臨床療效
（2）抗GPRC5D CAR-T治療后GPRC5D基因的雙等位缺失
患者1為女性MM復發患者，在接受抗GPRC5D CAR-T治療后18個月復發，骨髓漿細胞浸潤達24%。WGS分析揭示其染色體12p區域存在264 kb雜合缺失和22 kb純合缺失，完全覆蓋GPRC5D基因編碼區，導致雙等位基因失活。qPCR驗證實驗顯示復發樣本中同時檢出雜合和純合缺失拷貝（基線樣本均陰性），證實該缺失為治療后獲得性克隆選擇或治療前極低頻克隆擴增所致。IHC染色顯示，GPRC5D在基線高表達，復發后完全缺失，而CD138表達保持穩定，驗證其抗原逃逸的特異性。此案例首次在GPRC5D CAR-T背景下證實純合缺失是抗原逃逸的主要機制，與BCMA CAR-T耐藥機制高度相似，提示不同靶點CAR-T治療面臨共同的基因突變逃逸風險。
圖2：抗GPRC5D CAR-T細胞治療后患者1的GPRC5D基因雙等位缺失
（3）CAR-T治療后GPRC5D調控區域的純合缺失
患者6為復雜性核型κ輕鏈MM，GPRC5D CAR-T治療后13.9個月復發并進展為漿細胞白血病。WGS測序分析揭示其12號染色體上三個缺失片段：13.1 Mb雜合缺失、12.7 Mb雜合缺失和68.2 kb純合缺失。qPCR證實缺失斷點僅見于復發樣本，且純合缺失覆蓋GPRC5D啟動子及增強子區域，導致轉錄徹底沉默。RNA-seq未檢出缺失exon1的替代轉錄本，證實該缺失的功能破壞性。IHC顯示復發樣本中GPRC5D陰性細胞占主導，但仍有36.7%細胞保留GPRC5D表達，與qPCR評估的亞克隆比例高度吻合。表明調控區域缺失可通過破壞轉錄啟動導致抗原免疫逃逸，僅需小片段雙等位缺失即可實現抗原沉默，且可與其他亞克隆的雜合缺失共存，形成復雜的克隆異質性圖譜。該機制在CAR-T領域屬首次系統證實。
圖3：CAR-T細胞治療后患者6的GPRC5D調控元件純合缺失
（4）CAR免疫風險導致BCMA與GPRC5D雙重丟失
患者10序貫接受抗BCMA CAR-T（4個月后復發）和抗GPRC5D CAR-T治療（3個月后再次復發），該IgG-κ型MM女性經7線治療后進展為漿細胞白血病伴腹部EMD。復發樣本的WGS分析揭示16號染色體存在1.02 Mb雜合缺失和5個局灶性純合缺失，導致TNFRSF17（BCMA編碼基因）雙等位失活；12號染色體則存在13.3 Mb雜合缺失和3個局灶性純合缺失，導致GPRC5D雙等位失活。qPCR驗證至少5個TNFRSF17和3個GPRC5D純合缺失斷點，提示基因組不穩定性驅動下多克隆并行演化。該患者經多線治療后演變為至少15條染色體的復雜核型，證實患者基因組不穩定性容易介導多靶點抗原丟失。流式與IHC實驗結果顯示，治療前BCMA與GPRC5D雙高表達，復發后雙抗原均陰性，導致CAR-T策略失效。此案例分析結果表明，對于基因組不穩定的高�；颊�，單靶點序貫治療可能加速多抗原逃逸，多靶點CAR-T（如BCMA/GPRC5D雙特異CAR）或聯合去甲基化干預可能是更優選擇。
圖4：患者10接受序貫抗BCMA和抗GPRC5D CAR-T細胞治療后BCMA與GPRC5D雙重丟失
圖5：全基因組測序（WGS）揭示BCMA和GPRC5D雙重丟失的基因組學機制
（5）CAR-T治療后復發MM細胞中GPRC5D的表觀遺傳沉默
在7例WGS未檢出GPRC5D基因突變的復發患者中，WGBS分析結果顯示5例MM復發患者存在GPRC5D調控區域高甲基化，靶向甲基化測序（Target-BS）分析結果顯示多個CpG位點甲基化水平與GPRC5D表達負相關，揭示表觀遺傳重編程是主要逃逸機制。具體而言，復發MM細胞的全基因組甲基化水平相較于正常漿細胞呈顯著低甲基化（MM特征），但相較于未接受GPRC5D治療的對照MM細胞則表現為高甲基化，WGBS共鑒定出735.8萬高甲基化DMLs和72萬高甲基化DMRs，提示CAR-T治療誘導特異性甲基化重編程。靶向GPRC5D位點的Target-BS測序分析揭示，5例復發患者在轉錄調控元件（啟動子、增強子及內含子-外顯子邊界）呈現多位點高甲基化，而7例對照MM樣本該區域均維持低甲基化狀態。值得注意的是，兩例正常漿細胞對照（GPRC5D陽性率僅10.1%和12.9%）也在該區域顯示高甲基化，提示GPRC5D甲基化水平與表達呈負相關。
細胞系實驗中，阿扎胞苷處理可誘導高甲基化細胞系（如RPMI-8226）的GPRC5D mRNA和蛋白表達上調，證明DNA高甲基化是獨立的抗原沉默機制。
圖6：GPRC5D CAR-T細胞治療后多發性骨髓瘤細胞中GPRC5D位點的DNA高甲基化。
(A-B) 復發MM組與正常漿細胞(A)及對照MM組(B)相比，低甲基化或高甲基化差異甲基化區域(DMRs)的圈圖。圖中突出顯示前10,000個DMRs。圈位置表示甲基化差異的顯著性，紅色圓圈代表高甲基化DMRs，其位置越靠外表示顯著性越高；藍色圓圈代表低甲基化DMRs，其位置越靠內表示顯著性越高。(C) IGV展示GPRC5D位點的DNA甲基化圖譜。
圖7：多發性骨髓瘤細胞系中GPRC5D表達與甲基化水平的相關性。
(A) 7種多發性骨髓瘤細胞系GPRC5D基因調控區域靶基因甲基化Target-BS分析。IGV可視化展示CpG位點的甲基化信號。(B) 多發性骨髓瘤細胞系中GPRC5D mRNA表達的qPCR分析。
(C) GPRC5D mRNA水平倍數變化與其調控區差異甲基化CpG位點平均甲基化水平之間的相關性分析。
(D) 阿扎胞苷處理誘導GPRC5D mRNA表達增加。
(E) 流式細胞術檢測顯示，RPMI-8226細胞經72小時阿扎胞苷處理后GPRC5D蛋白表達升高。
結論和啟示
本研究證實GPRC5D免疫逃逸是CAR-T耐藥的主要機制，且存在表觀遺傳沉默與遺傳缺失。研究者發現去甲基化藥物在細胞系中可部分逆轉沉默，但臨床轉化需進一步優化給藥策略�？傊邢騁PRC5D的聯合療法（如CAR-T+去甲基化藥物）可能是克服耐藥的新方向，未來研究需動態監測甲基化水平，實現耐藥克隆的早期干預。
易基因的TBS技術是本研究從發現到驗證的關鍵工具。TBS通過靶向捕獲實現了：
超高深度：在GPRC5D調控區達到500×以上測序深度，精確檢測單個CpG位點甲基化水平，分辨低豐度耐藥亞克隆（<5%）。
成本效益：適合大規模樣本隊列（如本研究7個細胞系+多例臨床樣本）的快速驗證，為WGBS發現的重要DMRs提供經濟可行的臨床轉化路徑。
功能關聯：TBS數據與qPCR表達數據精準配對，建立甲基化-表達回歸模型，篩選出調控效能最強的CpG位點，為后續開發甲基化特異性引物用于MRD監測提供靶點。
參考文獻：
Ma S, Xia J, Zhang M, Li W, Xiao M, Sha Y, Wang W, Zhou J, Wang Y, Qi K, Fu C, Sun Z, Zhou D, Sun Q, Qiu T, Yan Z, Zhu F, Chen W, Cheng H, Sang W, Cao J, Li D, Li ZZ, Fulciniti M, Yao Y, Xu K, Niu M. Genetic and epigenetic mechanisms of GPRC5D loss after anti-GPRC5D CAR T-cell therapy in multiple myeloma. Blood. 2025 Mar 16. doi: 10.1182/blood.2024026622.
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