Science：利用大規(guī)模并行核糖體分析發(fā)現泛病毒ORF
2025年6月12日，美國麻省理工和博德研究所Pardis C.Sabeti團隊在Science上發(fā)表了一篇題為“Pan-viral ORFs discovery using massively parallel ribosome profiling”的論文，結合寡核苷酸合成文庫和Ribo-seq核糖體印跡分析，開展泛病毒ORF挖掘，本研究旨在建立一種高效、無偏的泛病毒ORFs發(fā)現方法，填補病毒翻譯組學空白。
一、引言
盡管病毒基因組測序技術已有很大進展， 但病毒基因組的功能注釋長期滯后于測序進展。除了已注釋的經典開放閱讀框（ORFs）之外，尤其是不符合傳統(tǒng)ORF的定義的非經典ORFs（如非ATG起始、長度<100aa）在感染、免疫調控中的作用尚未系統(tǒng)探索。
傳統(tǒng)的病毒基因組注釋方法主要依賴于生物信息學預測，存在假陽性率高、無法區(qū)分功能性和非功能性ORFs等局限性。更重要的是，許多高致病性病毒（如埃博拉病毒、尼帕病毒等）難以在實驗室條件下培養(yǎng)，需要在生物安全三級（BSL-3）或四級（BSL-4）設施中操作，極大限制了對這些病毒基因組的深入研究。
核糖體印跡分析也稱為Ribo-seq，此項技術的發(fā)展極大提升了檢測基因組翻譯區(qū)域的能力。該技術利用對核糖體結合的RNA片段進行深度測序，確定核糖體占位情況，從而以單核苷酸分辨率揭示翻譯區(qū)域。它已經在哺乳動物細胞、酵母、細菌和病毒中發(fā)現了許多非經典ORFs，包括5′非翻譯區(qū)（5′UTRs）中的上游ORFs（uORFs）和上游重疊ORFs（uoORFs）、非編碼RNA中的短ORFs以及已注釋編碼序列中的重疊內部ORFs（iORFs）。
然而，傳統(tǒng)核糖體圖譜技術在病毒研究中面臨三大瓶頸：病毒培養(yǎng)困難、安全要求高、遺傳多樣性強。每種病毒需要特定的培養(yǎng)系統(tǒng)，部分病毒無法在實驗室培養(yǎng)；高致病性病毒需要高等級生物安全設施；單一病毒株分析無法覆蓋變異譜系，導致全球多數病毒的翻譯圖譜仍是"黑箱"。
為解決這些挑戰(zhàn)，博德研究所的Shira Weingarten-Gabbay和Pardis C. Sabeti團隊開發(fā)了大規(guī)模平行核糖體圖譜（MPRP）技術。該技術創(chuàng)新性地將高通量寡核苷酸合成與核糖體圖譜技術相結合，在一次實驗中可同時分析數百種病毒的翻譯事件，無需病毒培養(yǎng)或高生物安全等級設施，極大降低了實驗門檻。這一技術突破為病毒基因組研究提供了全新的方法學工具，有望徹底改變我們對病毒蛋白質組的認知。
二、技術設計與方法
MPRP技術的核心原理是利用合成寡核苷酸文庫替代活病毒，通過Ribo檢測病毒基因組片段的翻譯活性。
1.文庫構建：研究團隊設計了包含20,170個合成寡核苷酸的文庫，覆蓋679種人類相關病毒基因組的3,976個基因的5'非翻譯區(qū)（5'UTR）和編碼區(qū)起始區(qū)域。每個寡核苷酸包含60個核苷酸的5'UTR和140個核苷酸的編碼區(qū)，確保能夠捕獲翻譯起始位點和上游調控序列。
2.并行檢測：將文庫轉染至HEK293T/A549細胞，在病毒感染相關應激條件（如poly(I:C)、內質網應激）下進行核糖體分析，使用抑制劑區(qū)分起始/延伸核糖體。
3.數據處理：采用PRICE（Probabilistic Ribo-seq Inference of Coding Exons）算法從核糖體足跡數據中推斷ORFs，并通過免疫肽組學驗證HLA-I呈遞。
4.跨平臺驗證：對比MPRP數據與HCMV、VSV等天然感染細胞的Ribo-seq結果，確保可靠性。
三、研究結果
3.1 病毒ORFs的大規(guī)模發(fā)現
MPRP技術在679種病毒中實現了數量級的發(fā)現突破，共鑒定出5,381個病毒ORFs，其中4,208個為非經典ORFs，覆蓋皰疹病毒、冠狀病毒、絲狀病毒等21個病毒家族。這些新發(fā)現的ORFs極大擴展了我們對病毒蛋白質組的認知邊界，揭示了病毒基因組中存在大量此前未被注釋的翻譯區(qū)域。
ORF類型的多樣性令人矚目。研究發(fā)現了多種類型的非經典ORFs：上游ORFs（uORFs）位于5'UTR區(qū)域，如HCMV UL45 5'UTR的uORF可導致核糖體停滯，抑制主CDS翻譯；內部重疊ORFs（iORFs）如IAV M1基因+1框架的iORF，在H5N1等6種流感毒株中保守存在；非ATG起始ORFs如HCMV中以GUG、UUG起始的ORFs，編碼20個氨基酸以下的微蛋白。這些不同類型的ORFs可能在病毒生命周期中發(fā)揮多樣化的功能。
盡管病毒基因組測序技術已有很大進展， 但病毒基因組的功能注釋長期滯后于測序進展。除了已注釋的經典開放閱讀框（ORFs）之外，尤其是不符合傳統(tǒng)ORF的定義的非經典ORFs（如非ATG起始、長度<100aa）在感染、免疫調控中的作用尚未系統(tǒng)探索。
傳統(tǒng)的病毒基因組注釋方法主要依賴于生物信息學預測，存在假陽性率高、無法區(qū)分功能性和非功能性ORFs等局限性。更重要的是，許多高致病性病毒（如埃博拉病毒、尼帕病毒等）難以在實驗室條件下培養(yǎng)，需要在生物安全三級（BSL-3）或四級（BSL-4）設施中操作，極大限制了對這些病毒基因組的深入研究。
核糖體印跡分析也稱為Ribo-seq，此項技術的發(fā)展極大提升了檢測基因組翻譯區(qū)域的能力。該技術利用對核糖體結合的RNA片段進行深度測序，確定核糖體占位情況，從而以單核苷酸分辨率揭示翻譯區(qū)域。它已經在哺乳動物細胞、酵母、細菌和病毒中發(fā)現了許多非經典ORFs，包括5′非翻譯區(qū)（5′UTRs）中的上游ORFs（uORFs）和上游重疊ORFs（uoORFs）、非編碼RNA中的短ORFs以及已注釋編碼序列中的重疊內部ORFs（iORFs）。
然而，傳統(tǒng)核糖體圖譜技術在病毒研究中面臨三大瓶頸：病毒培養(yǎng)困難、安全要求高、遺傳多樣性強。每種病毒需要特定的培養(yǎng)系統(tǒng)，部分病毒無法在實驗室培養(yǎng)；高致病性病毒需要高等級生物安全設施；單一病毒株分析無法覆蓋變異譜系，導致全球多數病毒的翻譯圖譜仍是"黑箱"。
為解決這些挑戰(zhàn)，博德研究所的Shira Weingarten-Gabbay和Pardis C. Sabeti團隊開發(fā)了大規(guī)模平行核糖體圖譜（MPRP）技術。該技術創(chuàng)新性地將高通量寡核苷酸合成與核糖體圖譜技術相結合，在一次實驗中可同時分析數百種病毒的翻譯事件，無需病毒培養(yǎng)或高生物安全等級設施，極大降低了實驗門檻。這一技術突破為病毒基因組研究提供了全新的方法學工具，有望徹底改變我們對病毒蛋白質組的認知。
二、技術設計與方法
MPRP技術的核心原理是利用合成寡核苷酸文庫替代活病毒，通過Ribo檢測病毒基因組片段的翻譯活性。
1.文庫構建：研究團隊設計了包含20,170個合成寡核苷酸的文庫，覆蓋679種人類相關病毒基因組的3,976個基因的5'非翻譯區(qū)（5'UTR）和編碼區(qū)起始區(qū)域。每個寡核苷酸包含60個核苷酸的5'UTR和140個核苷酸的編碼區(qū)，確保能夠捕獲翻譯起始位點和上游調控序列。
2.并行檢測：將文庫轉染至HEK293T/A549細胞，在病毒感染相關應激條件（如poly(I:C)、內質網應激）下進行核糖體分析，使用抑制劑區(qū)分起始/延伸核糖體。
3.數據處理：采用PRICE（Probabilistic Ribo-seq Inference of Coding Exons）算法從核糖體足跡數據中推斷ORFs，并通過免疫肽組學驗證HLA-I呈遞。
4.跨平臺驗證：對比MPRP數據與HCMV、VSV等天然感染細胞的Ribo-seq結果，確保可靠性。
三、研究結果
3.1 病毒ORFs的大規(guī)模發(fā)現
MPRP技術在679種病毒中實現了數量級的發(fā)現突破，共鑒定出5,381個病毒ORFs，其中4,208個為非經典ORFs，覆蓋皰疹病毒、冠狀病毒、絲狀病毒等21個病毒家族。這些新發(fā)現的ORFs極大擴展了我們對病毒蛋白質組的認知邊界，揭示了病毒基因組中存在大量此前未被注釋的翻譯區(qū)域。
ORF類型的多樣性令人矚目。研究發(fā)現了多種類型的非經典ORFs：上游ORFs（uORFs）位于5'UTR區(qū)域，如HCMV UL45 5'UTR的uORF可導致核糖體停滯，抑制主CDS翻譯；內部重疊ORFs（iORFs）如IAV M1基因+1框架的iORF，在H5N1等6種流感毒株中保守存在；非ATG起始ORFs如HCMV中以GUG、UUG起始的ORFs，編碼20個氨基酸以下的微蛋白。這些不同類型的ORFs可能在病毒生命周期中發(fā)揮多樣化的功能。
技術性能評估顯示，在3,976個注釋的病毒CDS中，PRICE算法成功捕獲了1,136個（28%）在注釋起始密碼子處起始的ORFs，錯誤發(fā)現率為0.05。雖然捕獲率看似不高，但考慮到實驗系統(tǒng)的復雜性和病毒基因組的多樣性，這一結果仍具有重要意義。更重要的是，PRICE檢測到的CDS在兩個生物學重復中的核糖體占用率顯示出高相關性（R=0.93），證明了檢測結果的可靠性。
3.2 非經典ORFs的免疫原性驗證
研究的一個重要發(fā)現是非經典ORFs具有顯著的免疫原性。通過分析感染細胞的免疫肽組數據集，研究團隊發(fā)現MPRP鑒定的非經典ORFs能夠產生人類白細胞抗原I類（HLA-I）相關肽段。在HCMV中發(fā)現了4個非經典ORF來源的5種肽段，如UL4 5'UTR uORF的VLSAKKLS、UL135 5'UTR uoORF的YPAPRPQAI；在VACV中發(fā)現了2種肽段，如L3L iORF的HRNKIINAEK，這些肽段均被HLAthena預測為高親和力HLA-I結合者（MSi rank ≤2）。
免疫貢獻的量化分析揭示了非經典ORFs的重要性。將MPRP鑒定的ORF納入HCMV注釋后，HLA-I呈遞肽段數量增加7.4%，且非經典ORF的單位長度產肽量顯著高于經典ORF（P<10⁻³）。這一發(fā)現表明，非經典ORFs不僅能夠編碼功能性肽段，還具有更高的免疫原性密度，可能在病毒免疫逃逸和宿主免疫應答中發(fā)揮重要作用。
研究的一個重要發(fā)現是非經典ORFs具有顯著的免疫原性。通過分析感染細胞的免疫肽組數據集，研究團隊發(fā)現MPRP鑒定的非經典ORFs能夠產生人類白細胞抗原I類（HLA-I）相關肽段。在HCMV中發(fā)現了4個非經典ORF來源的5種肽段，如UL4 5'UTR uORF的VLSAKKLS、UL135 5'UTR uoORF的YPAPRPQAI；在VACV中發(fā)現了2種肽段，如L3L iORF的HRNKIINAEK，這些肽段均被HLAthena預測為高親和力HLA-I結合者（MSi rank ≤2）。
免疫貢獻的量化分析揭示了非經典ORFs的重要性。將MPRP鑒定的ORF納入HCMV注釋后，HLA-I呈遞肽段數量增加7.4%，且非經典ORF的單位長度產肽量顯著高于經典ORF（P<10⁻³）。這一發(fā)現表明，非經典ORFs不僅能夠編碼功能性肽段，還具有更高的免疫原性密度，可能在病毒免疫逃逸和宿主免疫應答中發(fā)揮重要作用。
3.3 uORF對病毒翻譯的調控機制
研究揭示了上游ORFs（uORFs）對病毒蛋白翻譯的精細調控機制。在正常條件下，2,418個病毒基因中37%的核糖體聚集在5'UTR（uORF區(qū)域），抑制主CDS翻譯；亞砷酸鈉誘導eIF2α磷酸化后，核糖體向CDS轉移，5'UTR聚集比例降至19%，證實uORF通過eIF2α通路調控翻譯起始。
功能保守性證據表明uORF的調控作用在不同實驗條件下具有一致性。HCMV UL4 5'UTR的uORF在MPRP和天然感染細胞中均導致核糖體停滯，其編碼的核糖體停滯肽（RAP）可抑制主蛋白翻譯。三核苷酸周期性分析顯示，在5'UTR區(qū)域檢測到的uORFs具有活躍的核糖體翻譯特征，且在LTM抑制劑存在下，這些uORFs的起始密碼子處顯示強烈的起始核糖體信號。
研究還發(fā)現，在應激條件下（如eIF2α磷酸化），核糖體更容易繞過5'UTR中的uORFs，在主CDS處起始翻譯，這與抑制性uORF的預期行為一致。這一發(fā)現為理解病毒如何在不同細胞環(huán)境中調控蛋白合成提供了重要見解，也為開發(fā)針對病毒翻譯調控的治療策略提供了潛在靶點。
研究揭示了上游ORFs（uORFs）對病毒蛋白翻譯的精細調控機制。在正常條件下，2,418個病毒基因中37%的核糖體聚集在5'UTR（uORF區(qū)域），抑制主CDS翻譯；亞砷酸鈉誘導eIF2α磷酸化后，核糖體向CDS轉移，5'UTR聚集比例降至19%，證實uORF通過eIF2α通路調控翻譯起始。
功能保守性證據表明uORF的調控作用在不同實驗條件下具有一致性。HCMV UL4 5'UTR的uORF在MPRP和天然感染細胞中均導致核糖體停滯，其編碼的核糖體停滯肽（RAP）可抑制主蛋白翻譯。三核苷酸周期性分析顯示，在5'UTR區(qū)域檢測到的uORFs具有活躍的核糖體翻譯特征，且在LTM抑制劑存在下，這些uORFs的起始密碼子處顯示強烈的起始核糖體信號。
研究還發(fā)現，在應激條件下（如eIF2α磷酸化），核糖體更容易繞過5'UTR中的uORFs，在主CDS處起始翻譯，這與抑制性uORF的預期行為一致。這一發(fā)現為理解病毒如何在不同細胞環(huán)境中調控蛋白合成提供了重要見解，也為開發(fā)針對病毒翻譯調控的治療策略提供了潛在靶點。
四、結論
MPRP技術為病毒基因組研究帶來了范式轉變，通過揭示病毒基因組中大量"隱藏"的ORFs， 不僅擴展了病毒蛋白質組的邊界，更為疫苗開發(fā)、抗病毒藥物研發(fā)和疫情防控提供了重要機遇。 這一技術突破不僅是科學技術的進步，更是人類抗擊病毒的重要武器。
MPRP技術為病毒基因組研究帶來了范式轉變，通過揭示病毒基因組中大量"隱藏"的ORFs， 不僅擴展了病毒蛋白質組的邊界，更為疫苗開發(fā)、抗病毒藥物研發(fā)和疫情防控提供了重要機遇。 這一技術突破不僅是科學技術的進步，更是人類抗擊病毒的重要武器。
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