多組學(xué)分析揭示DNA低甲基化定義人組織調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表觀遺傳適應(yīng)性

2025年7月16日，德國(guó)雷根斯堡大學(xué)Markus Feuerer教授和美因茨大學(xué)Michael Delacher 教授團(tuán)隊(duì)合作，通過(guò)整合人類皮膚組織和血液中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells，Treg細(xì)胞）的全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）、染色質(zhì)可及性測(cè)序（ATAC-seq）和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）多組學(xué)數(shù)據(jù)，系統(tǒng)解析了人類皮膚組織和血液中Treg細(xì)胞的表觀遺傳特征。本研究發(fā)現(xiàn)皮膚Treg細(xì)胞表現(xiàn)出以DNA低甲基化為主的組織適應(yīng)性呈現(xiàn)狀態(tài)，尤其發(fā)生在轉(zhuǎn)座子元件（TE）區(qū)域。進(jìn)一步研究證實(shí)，血液中CCR8+ Treg細(xì)胞在DNA甲基化模式上與皮膚Treg高度相似，但在染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)上部分差異，提示其可能是從皮膚組織再循環(huán)至血液的Treg細(xì)胞。該研究首次利用多組學(xué)定義了人多組織Treg細(xì)胞的表觀遺傳適應(yīng)性狀態(tài)，并提出了CCR8+ Treg作為循環(huán)中組織來(lái)源Treg的甲基化標(biāo)志。相關(guān)研究成果以“DNA hypomethylation traits define human regulatory T cells in cutaneous tissue and identify their blood recirculating counterparts”為題發(fā)表在免疫學(xué)相關(guān)領(lǐng)域頂刊《Nature immunology》。

• 皮膚組織Treg細(xì)胞：來(lái)自7名健康女性捐贈(zèng)者的皮膚組織。
• 血液Treg細(xì)胞：從10例健康女性血小板捐贈(zèng)者的白細(xì)胞減除腔中分離外周血單核細(xì)胞（PBMCs），包括CCR8+ Treg、CD45RA+ naive Treg和常規(guī)T細(xì)胞（Tconv）。
• 脂肪組織Treg細(xì)胞：來(lái)自皮下脂肪，用于驗(yàn)證組織保守性。

表觀多組學(xué)測(cè)序分析：

• WGBS（全基因組亞硫酸鹽測(cè)序）：用于全基因組DNA甲基化分析，覆蓋約2.8M CpG位點(diǎn)，中位覆蓋度2–7×。
• ATAC-seq（染色質(zhì)可及性測(cè)序）：利用公開數(shù)據(jù)及自行生成的數(shù)據(jù)，分析染色質(zhì)開放區(qū)域。
• RNA-seq（轉(zhuǎn)錄組測(cè)序）：分析基因表達(dá)差異，部分?jǐn)?shù)據(jù)來(lái)源于公開數(shù)據(jù)庫(kù)。
• 多組學(xué)整合：通過(guò)重疊DMRs、差異可及性峰值和差異表達(dá)基因，構(gòu)建“DMR–peak–gene links”關(guān)聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

驗(yàn)證分析：

• T細(xì)胞受體（TCR）追蹤：利用scRNA-seq/scTCR-seq數(shù)據(jù)，通過(guò)TCR克隆型重疊評(píng)估細(xì)胞來(lái)源同一性。
• 小鼠模型驗(yàn)證：使用光轉(zhuǎn)換Kaede小鼠（Tg(CAG-Kaede)15Kgwa）追蹤皮膚Treg細(xì)胞向引流淋巴結(jié)的遷移，并結(jié)合CCR8表達(dá)分析。

圖1：皮膚Treg細(xì)胞和血液CCR8+ Treg細(xì)胞與血液CD45RA+ Treg細(xì)胞的DNA甲基化分析

a. 流式細(xì)胞術(shù)代表性圖譜顯示人類血液、脂肪和皮膚中CD4+CD127-CD25+ Treg細(xì)胞亞群的CD45RA-CCR8+ Treg細(xì)胞（左圖），以及人類血液與皮膚中CD4+ CD127-CD25+ Treg細(xì)胞亞群的CD45RA-CCR8+ Treg細(xì)胞比例。
b. 分選策略示意圖顯示從1例健康女性供者中分離血液CD45RA+ Treg細(xì)胞、血液CD45RA+ Tconv細(xì)胞、血液CCR8+ Treg細(xì)胞、皮膚Tconv細(xì)胞和皮膚Treg細(xì)胞。
c. 對(duì)來(lái)自9例健康女性供者的血液和皮膚和血液中分離的血液CD45RA+ Treg細(xì)胞（RA+ Treg細(xì)胞）、血液CD45RA+ Tconv細(xì)胞（RA+ Tconv細(xì)胞）、血液CCR8+ Treg細(xì)胞、皮膚Tconv細(xì)胞和皮膚Treg細(xì)胞進(jìn)行DNA甲基化主成分分析。
d. c中供者的人類血液CD45RA+ Treg細(xì)胞、血液CCR8+ Treg細(xì)胞、皮膚Tconv細(xì)胞和皮膚Treg細(xì)胞中按基因組位置顯示的甲基化水平，以及與血液CD45RA+ Tconv細(xì)胞的差異分析。
e. 任意兩種細(xì)胞類型之間最顯著甲基化差異（紅色箭頭）提取細(xì)胞類型特征，從而篩選出特征區(qū)域。
f. e中所選細(xì)胞類型特征區(qū)域的DNA甲基化情況。
g. e中特征區(qū)域的細(xì)胞類型特征在由基因定義的基因組區(qū)間（上圖）和CpG島（下圖）中的分布。

（2）多組學(xué)揭示差異甲基化區(qū)域-染色質(zhì)開放峰-基因表達(dá)關(guān)聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（DMR–peak–gene links）
為建立DNA甲基化與功能調(diào)控的直接聯(lián)系，研究整合WGBS數(shù)據(jù)與已發(fā)表的scATAC-seq及bulk RNA-seq數(shù)據(jù)，構(gòu)建了"DMR-peak-gene"關(guān)聯(lián)分析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，即一個(gè)基因組區(qū)域同時(shí)存在差異甲基化、差異可及性和關(guān)聯(lián)基因差異表達(dá)。在比較血液CD45RA+ naïve Treg 和Tconv細(xì)胞，共鑒定出超3600個(gè)差異甲基化區(qū)域（DMRs），其中包含TNFRSF1B、TNFRSF9、IKZF2、IKZF4、FOXP3等經(jīng)典Treg功能基因。進(jìn)一步整合形成了151個(gè)DMR–peak–gene links，涉及73個(gè)基因。

在Treg表征位點(diǎn)（如FOXP3、TIGIT、IL2RA、CTLA4、TNFRSF1B）上，WGBS揭示的低甲基化模式與ATAC-seq檢測(cè)的染色質(zhì)開放及RNA-seq檢測(cè)的高表達(dá)呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。此外，研究通過(guò)靶基因亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)，在6例獨(dú)立男性供者中驗(yàn)證了FOXP3、TIGIT、IL2RA、TNFRSF1B、LRRN3和SYTL3等位點(diǎn)的甲基化差異。這些關(guān)聯(lián)分析揭示了甲基化變化如何通過(guò)染色質(zhì)可及性調(diào)控基因表達(dá)，為理解Treg細(xì)胞功能調(diào)控提供了多組學(xué)證據(jù)鏈。
 

a. 血液CD45RA+ Treg細(xì)胞（RA+ Treg細(xì)胞）與血液CD45RA+ Tconv細(xì)胞（RA+ Tconv細(xì)胞）之間差異甲基化區(qū)域（左）、差異可及性peaks（中）和差異表達(dá)基因（右）的甲基化、染色質(zhì)可及性和表達(dá)。
b. DMR–peak–gene關(guān)聯(lián)分析（n=151）中差異甲基化、可及性和表達(dá)之間的相關(guān)性。
c. 血液CD45RA+ Treg細(xì)胞和血液CD45RA+ Tconv細(xì)胞中選定DMR–peak–gene關(guān)聯(lián)的平滑甲基化（左上）、原始甲基化（右上）、染色質(zhì)可及性（左下）和表達(dá)（右下）。
d. Taregt-BS測(cè)序顯示選定區(qū)域血液CD45RA+ Treg細(xì)胞與血液CD45RA+ Tconv細(xì)胞的甲基化差異。

（3）皮膚Treg細(xì)胞組織適應(yīng)具有多組學(xué)特征
為研究皮膚Treg細(xì)胞的組織特異性適應(yīng)過(guò)程，研究團(tuán)隊(duì)鑒定出300,199個(gè)DMRs（其中298,457個(gè)為低甲基化）、8,914個(gè)差異可及性峰（3,192個(gè)高開放）和6,877個(gè)差異表達(dá)基因（4,049個(gè)高表達(dá)）。通過(guò)DMR-peak-gene關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)1,203個(gè)三聯(lián)關(guān)聯(lián)中，813個(gè)表現(xiàn)為低甲基化-高開放-高表達(dá)模式，涉及TNFRSF8（CD30）、RELB、CCR8、PRDM1和BATF等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。WGBS數(shù)據(jù)顯示，這些DMR甲基化水平變化程度遠(yuǎn)高于染色質(zhì)可及性變化，提示DNA甲基化可能是促進(jìn)組織適應(yīng)的"主開關(guān)"。功能富集分析表明，低甲基化關(guān)聯(lián)基因顯著富集于IL-2-STAT5信號(hào)、TNF信號(hào)、TGFβ信號(hào)等Treg細(xì)胞核心通路。值得注意的是，將皮膚Treg特征與脂肪組織Treg數(shù)據(jù)交叉驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)脂肪Treg細(xì)胞中共有絕大多數(shù)低甲基化特征，證明了WGBS鑒定的表觀遺傳適應(yīng)程序在不同組織的Treg細(xì)胞間具有保守性。該結(jié)果揭示，組織Treg細(xì)胞的適應(yīng)過(guò)程本質(zhì)上是一個(gè)以DNA去甲基化為主導(dǎo)的大規(guī)模表觀遺傳重編程事件，而非簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)表達(dá)。
 

圖3：DMR–peak–gene關(guān)聯(lián)分析定義皮膚Treg細(xì)胞發(fā)育的多組學(xué)表征。

a. 皮膚Treg細(xì)胞與血液CD45RA+ Treg細(xì)胞（血液RA+ Treg細(xì)胞）之間差異甲基化區(qū)域（左）、差異可及性峰（中）和差異表達(dá)基因（右）的甲基化、染色質(zhì)可及性和表達(dá)情況。
b. DMR–peak–gene關(guān)聯(lián)（n=1,203個(gè)）中差異甲基化、可及性和基因表達(dá)之間的相關(guān)性。
c. 所選DMR–peak–gene關(guān)聯(lián)分析顯示在皮膚Treg細(xì)胞和血液CD45RA+ Treg細(xì)胞中的平滑甲基化（左上）、原始甲基化（右上）、染色質(zhì)可及性（左下）和基因表達(dá)（右下）。
d. 多組學(xué)分析顯示皮膚Treg細(xì)胞特征中基因的標(biāo)記基因集富集情況。

（4）bZIP和bHLH motif的甲基化模式標(biāo)記皮膚Treg細(xì)胞
通過(guò)解析DMRs中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)在皮膚Treg細(xì)胞低甲基化DMRs和高可及性峰中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子（如BATF、Jun-AP1）的結(jié)合motifs中顯著富集。而bHLH轉(zhuǎn)錄因子（如c-Myc、n-Myc、USF1）motif僅富集于低甲基化DMRs，未在可及性峰值中富集。這些結(jié)果表明，bZIP因子可能在皮膚Treg細(xì)胞適應(yīng)中同時(shí)受甲基化與可及性調(diào)控，而bHLH因子可能受甲基化調(diào)控進(jìn)而發(fā)揮功能。

為驗(yàn)證這些低甲基化位點(diǎn)功能，研究選取MLPH和GNA11位點(diǎn)的c-Myc結(jié)合位點(diǎn)，運(yùn)用CRISPR激活系統(tǒng)（CRISPRa）進(jìn)行靶向激活，結(jié)果顯示這兩個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，驗(yàn)證了c-Myc結(jié)合位點(diǎn)低甲基化與鄰近基因（如MLPH、GNAI1）表達(dá)上調(diào)的相關(guān)性。這一功能實(shí)驗(yàn)直接證明WGBS鑒定的低甲基化區(qū)域具有增強(qiáng)子活性，且其調(diào)控作用依賴于精確的甲基化狀態(tài)。