DAP-seq技術助力揭示小麥氮高效利用與產量提升的分子機制
2025年9月27日，中國農業大學孫其信院士/邢界文教授團隊在Molecular Plant（IF: 24.1）在線發表了題為An incoherent feed-forward loop coordinates nitrate uptake and tillering in wheat的研究論文，該研究揭示了小麥中TaNLP3通過非一致性前饋環（incoherent feed-forward loop）協同調控硝酸鹽吸收與分蘗的分子機制，還鑒定出可直接用于育種的優異單倍型。藍景科信為該研究提供了DAP-seq技術支持。
文章主要內容
小麥作為全球近20%人口的主食來源，其產量和氮素利用效率（NUE）直接關系到糧食安全與農業可持續發展。自綠色革命以來，氮肥施用大幅提升了小麥產量，但如今增產效應已進入平臺期——過量施氮不僅降低NUE，還會催生大量無效分蘗，造成資源浪費。如何讓小麥在氮素波動環境中“智能”平衡硝酸鹽吸收與有效分蘗，成為小麥遺傳改良中的核心問題。
主要研究結果
核心發現一：關鍵基因鑒定與功能解析——鎖定硝酸鹽響應核心因子
主要研究結果
核心發現一：關鍵基因鑒定與功能解析——鎖定硝酸鹽響應核心因子
- 關鍵標記基因鑒定：TaNRT2.1-6B4 是氮響應與分蘗的“信號樞紐”
本研究通過對缺氮后復氮處理的小麥幼苗進行不同時間點（15min、1h、6h）RNA-seq分析，結合GO富集分析與候選基因關聯分析，鑒定到TaNRT2.1-6B4為小麥硝酸鹽響應關鍵標記基因，其表達量與分蘗數呈顯著正相關，且受硝酸鹽強烈誘導（轉錄水平提升5-180倍），成為連接氮吸收與分蘗發育的關鍵“信號樞紐”。
- 核心調控因子鑒定：TaNLP3 是平衡氮吸收與分蘗的“總開關”
通過酵母單雜篩選TaNRT2.1-6B4的上游調控因子，團隊鑒定出NIN-like蛋白家族成員TaNLP3。轉錄組數據顯示，TaNLP3不受短期施氮誘導，且在不同氮磷供給組合條件下表達量保持穩定。亞細胞定位、瞬時熒光素酶（LUC）、酵母轉錄激活實驗等技術驗證基因表達特征與轉錄激活功能。結果顯示TaNLP3作為硝酸鹽信號通路的核心轉錄因子，定位于細胞質與細胞核，硝酸鹽處理可促進其核滯留，其C端具有最強轉錄激活活性，N端片段次之，全長蛋白的激活活性最弱。
圖1 TaNRT2.1-6B4 是受TaNLP3正調控的關鍵硝酸鹽響應標記基因
利用CRISPR-Cas9技術構建TaNLP3敲除株系，通過田間試驗（正常氮/低氮條件）與水培試驗，系統分析植株表型、氮含量及15N吸收速率，結果顯示TaNLP3敲除顯著降低小麥株高、分蘗數及產量，且在正常氮條件下表型缺陷更顯著，但植株氮含量未受影響；此外在硝酸鹽誘導（NI）條件下敲除TaNLP3抑制硝酸鹽吸收，而在低氮（LN）和正常氮（NN）穩態條件下不影響甚至促進吸收。表型分析表明，TaNLP3以氮素依賴的方式調控硝酸鹽吸收和小麥分蘗——在硝酸鹽誘導（短期氮信號）下，它主要促進硝酸鹽吸收；在正常氮供應（長期氮信號）下，它更側重調控分蘗發育，完美適配小麥在不同氮環境中的生長需求。
圖2 TaNLP3在短期和長期硝酸鹽處理下調控不同基因的表達
核心發現二：硝酸鹽信號調控網絡構建——解析協同調控分子路徑
1、TaNLP3–TaLBD38–TaNRT2.1 構成非一致性前饋環路
為解析TaNLP3在短期和長期硝酸鹽信號中功能背后的調控網絡，作者對TaNLP3敲除株系與Fielder對照在不同氮條件（NN、NS、NI）下的根系和地上部分進行轉錄組測序（RNA-seq），鑒定到調控小麥分蘗過程中的關鍵下游候選基因TaLBD38，原位雜交結果顯示，TaLBD38與TaNLP3均在小麥分蘗芽中表達，隨后通過對正常氮條件下生長的Fielder 和Tanlp3-4的分蘗芽進行了轉錄組測序驗證了TaNLP3–TaLBD38調控級聯在分蘗發育中的作用。
不同氮素條件下TaNRT2.1家族基因與TaLBD38的表達熱圖顯示，二者具有基因特異性的硝酸鹽響應模式，結合此前研究證實LBD家族成員參與氮素利用和地上部分枝調控，作者提出：小麥硝酸鹽信號通路中，TaNLP3、TaLBD38與TaNRT2.1構成非一致性前饋環路：短期信號中，TaNLP3感知硝酸鹽信號后進入細胞核，激活TaNRT2.1以增強硝酸鹽吸收，同時誘導TaLBD38 表達；長期信號傳導中，積累的TaLBD38蛋白會抑制TaNRT2.1的表達，避免硝酸鹽過量吸收，進而促進分蘗形成。進一步EMSA、LUC、ChIP-qPCR等分子實驗表明TaNLP3可結合并激活TaNRT2.1-6B4和TaLBD38-4A的啟動子；而TaLBD38則結合并抑制TaNRT2.1-6B4的啟動子。EMS突變體的RT-qPCR、表型與氮含量測定證實TaLBD38缺失會致氮吸收異常與發育缺陷。上述結果均證明該環路實現了硝態氮吸收與分蘗形成的動態平衡。
1、TaNLP3–TaLBD38–TaNRT2.1 構成非一致性前饋環路
為解析TaNLP3在短期和長期硝酸鹽信號中功能背后的調控網絡，作者對TaNLP3敲除株系與Fielder對照在不同氮條件（NN、NS、NI）下的根系和地上部分進行轉錄組測序（RNA-seq），鑒定到調控小麥分蘗過程中的關鍵下游候選基因TaLBD38，原位雜交結果顯示，TaLBD38與TaNLP3均在小麥分蘗芽中表達，隨后通過對正常氮條件下生長的Fielder 和Tanlp3-4的分蘗芽進行了轉錄組測序驗證了TaNLP3–TaLBD38調控級聯在分蘗發育中的作用。
不同氮素條件下TaNRT2.1家族基因與TaLBD38的表達熱圖顯示，二者具有基因特異性的硝酸鹽響應模式，結合此前研究證實LBD家族成員參與氮素利用和地上部分枝調控，作者提出：小麥硝酸鹽信號通路中，TaNLP3、TaLBD38與TaNRT2.1構成非一致性前饋環路：短期信號中，TaNLP3感知硝酸鹽信號后進入細胞核，激活TaNRT2.1以增強硝酸鹽吸收，同時誘導TaLBD38 表達；長期信號傳導中，積累的TaLBD38蛋白會抑制TaNRT2.1的表達，避免硝酸鹽過量吸收，進而促進分蘗形成。進一步EMSA、LUC、ChIP-qPCR等分子實驗表明TaNLP3可結合并激活TaNRT2.1-6B4和TaLBD38-4A的啟動子；而TaLBD38則結合并抑制TaNRT2.1-6B4的啟動子。EMS突變體的RT-qPCR、表型與氮含量測定證實TaLBD38缺失會致氮吸收異常與發育缺陷。上述結果均證明該環路實現了硝態氮吸收與分蘗形成的動態平衡。
圖3 TaNLP3通過非一致性前饋環調控TaNRT2.1與TaLBD38的表達，進而協同調控硝酸鹽吸收與分蘗
2、TaLBD38通過抑制TaCKX4/5調控分蘗
為篩選TaLBD38介導的分蘗調控關鍵基因，作者對野生型和3個TaLBD38 RNAi株系10天齡幼苗進行了轉錄組測序。根的轉錄組分析結果顯示，TaLBD38調控的差異基因廣泛參與養分利用過程，包括硝酸鹽轉運與同化、氨基酸轉運、鐵離子轉運及磷酸鹽調控。與根系DEGs不同，莖部DEGs富集于BR、赤霉素（GA）和細胞分裂素（CK）信號通路。由于TaLBD38是一種轉錄抑制因子，其直接調控靶點在RNAi細胞系中被上調。根據這一標準，結合水稻相關研究推斷出TaCKX4/5是介導TaLBD38調控分蘗的主要下游靶點。隨后通過RT-qPCR，LUC和EMSA實驗證實TaLBD38直接結合并抑制細胞分裂素降解酶基因TaCKX4/5的啟動子，提高局部細胞分裂素水平，促進分蘗形成。
為篩選TaLBD38介導的分蘗調控關鍵基因，作者對野生型和3個TaLBD38 RNAi株系10天齡幼苗進行了轉錄組測序。根的轉錄組分析結果顯示，TaLBD38調控的差異基因廣泛參與養分利用過程，包括硝酸鹽轉運與同化、氨基酸轉運、鐵離子轉運及磷酸鹽調控。與根系DEGs不同，莖部DEGs富集于BR、赤霉素（GA）和細胞分裂素（CK）信號通路。由于TaLBD38是一種轉錄抑制因子，其直接調控靶點在RNAi細胞系中被上調。根據這一標準，結合水稻相關研究推斷出TaCKX4/5是介導TaLBD38調控分蘗的主要下游靶點。隨后通過RT-qPCR，LUC和EMSA實驗證實TaLBD38直接結合并抑制細胞分裂素降解酶基因TaCKX4/5的啟動子，提高局部細胞分裂素水平，促進分蘗形成。
圖4 TaLBD38通過在根部抑制TaNRT2.1家族基因的表達以限制硝酸鹽吸收，同時在地上部抑制TaCKX4/5的表達以促進分蘗
核心發現三：染色質層面調控——TaNLP3與SWI/SNF復合物協同“解鎖”靶基因
為了揭示TaNLP3調控基因表達的深層機制，作者以TaNLP3為誘餌進行Y2H實驗，鑒定出62個候選相互作用物。其中，SWI/SNF染色質重塑復合物為關鍵物質。Co-IP、LUC和雙分子熒光互補實驗進一步證實TaNLP3無論體內體外均可與SWI/SNF亞基TaSYD、TaSNF5直接相互作用。
為了揭示TaNLP3調控基因表達的深層機制，作者以TaNLP3為誘餌進行Y2H實驗，鑒定出62個候選相互作用物。其中，SWI/SNF染色質重塑復合物為關鍵物質。Co-IP、LUC和雙分子熒光互補實驗進一步證實TaNLP3無論體內體外均可與SWI/SNF亞基TaSYD、TaSNF5直接相互作用。
圖5 SWI/SNF 染色質重塑復合體與 TaNLP3 相互作用，調控小麥硝酸鹽響應
為了研究TaNLP3敲除是否在全基因組水平上影響染色質狀態，團隊運用轉座酶可及性染色質測序（ATAC-seq）分析TaNLP3敲除株系與Fielder對照在NS和NI條件下的全基因組染色質可及性差異。結果顯示TaNLP3是硝酸鹽誘導的染色質重塑關鍵調控因子，并且鑒定到23365個受硝酸鹽和TaNLP3共同調控的可及染色質區域。為進一步明確哪些差異可及染色質區域可能受TaNLP3直接調控，作者進行了DNA親和純化測序（DAP-seq）鑒定TaNLP3的直接靶基因。兩個重復交集中鑒定到18941個靶基因，這些18941個基因共鑒定出54018個峰，其中90%的結合峰位于轉錄起始位點（TSS）上游5kb調控區。整合ATAC-seq和DAP-seq數據分析發現，4008個基因既與硝酸鹽和TaNLP3共同調控的可及染色質區域相關，又是DAP-seq鑒定的TaNLP3直接靶基因，這些重疊基因中包含許多氮素相關基因，包括參與硝酸鹽吸收、硝酸鹽同化和硝酸鹽信號調控的基因。IGV峰圖，顯示TaNRT2.1-6B4和TaLBD38-4A位點的染色質可及性顯著提高，且存在TaNLP3強結合信號，這些位點的DAP-seq峰為TaNLP3直接結合并調控這些關鍵硝酸鹽響應基因的啟動子提供了有力證據。染色質可及性的增加通常伴隨著活躍的表觀遺傳修飾，因此檢測了四個氮相關基因（TaNRT2.1-6B4、TaNIA1-6A、TaNIA1-6B 和TaLBD38-4A）啟動子區域的H3K9ac水平。ChIP–qPCR結果顯示NI條件下，Fielder中H3K9ac水平顯著高于NS條件；而敲除TaNLP3后，NI條件下H3K9ac水平大幅下降。這些發現表明，TaNLP3在小麥硝酸鹽響應過程中對染色質可及性的調控具有不可或缺的作用。
圖6 TaNLP3 通過調控其靶基因處的染色質可及性，進而調控硝酸鹽響應基因的表達
核心發現四：育種新資源——3個優異單倍型實現“高產+高NUE”
為評估TaNLP3-TaLBD38-TaNRT2.1調控模塊的育種潛力，團隊對405份小麥種質資源（359個栽培種、46個地方品種）進行單倍型分析，鑒定出3個關鍵基因的優異單倍型：TaNLP3-3BHap2、TaLBD38-4AHap2 和 TaNRT2.1-6B4Hap1。這些優異單倍型在現代栽培種中的頻率呈下降趨勢（部分從70%降至30%），這為通過分子標記輔助育種、回補優異單倍型提供了重要靶點——將這些單倍型聚合到同一品種中，有望培育出“低氮高產、高氮高效”的小麥新品種。
為評估TaNLP3-TaLBD38-TaNRT2.1調控模塊的育種潛力，團隊對405份小麥種質資源（359個栽培種、46個地方品種）進行單倍型分析，鑒定出3個關鍵基因的優異單倍型：TaNLP3-3BHap2、TaLBD38-4AHap2 和 TaNRT2.1-6B4Hap1。這些優異單倍型在現代栽培種中的頻率呈下降趨勢（部分從70%降至30%），這為通過分子標記輔助育種、回補優異單倍型提供了重要靶點——將這些單倍型聚合到同一品種中，有望培育出“低氮高產、高氮高效”的小麥新品種。
圖7 小麥種質資源中TaNLP3、TaLBD38 及 TaNRT2.1的單倍型分析
小結
該研究闡明了TaNLP3作為核心調控因子，通過與SWI/SNF復合體協作重塑染色質可及性，借助不一致性前饋環實現硝酸鹽吸收與分蘗形成的時空協同。不僅深化了對作物氮信號網絡的理解，也為通過分子設計培育“高產高效”小麥品種提供了新靶點與遺傳資源。
該研究闡明了TaNLP3作為核心調控因子，通過與SWI/SNF復合體協作重塑染色質可及性，借助不一致性前饋環實現硝酸鹽吸收與分蘗形成的時空協同。不僅深化了對作物氮信號網絡的理解，也為通過分子設計培育“高產高效”小麥品種提供了新靶點與遺傳資源。
圖8 TaNLP3介導的染色質可及性調控及小麥氮-分蘗平衡模型
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.molp.2025.09.020
標簽：
DAP-seq
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