LUNA-III™細胞計數儀在臺盼藍染色PBMC活力分析中的應用

關鍵詞：LUNA-III™ 自動細胞計數儀、PBMC、偏移校正功能、臺盼藍染色、細胞濃度與活力評估

介紹
外周血單核細胞（PBMC）在感染性疾病、自身免疫疾病和腫瘤免疫學等研究領域中發揮著至關重要的作用，確保研究結果的一致性和可重復性對于獲得可靠、精準的結論也至關重要。然而，由于PBMC的特性及樣本質量的影響，其精確計數面臨諸多挑戰。PBMC體積較小，邊緣不夠清晰，可能影響檢測準確性。此外由于PBMC來源于血液，其分離過程中常伴有大量細胞碎片和潛在的紅細胞（RBC）污染，這些因素可能降低自動對焦性能，從而導致細胞計數和活力測定的誤差。
       
鑒于上述限制，通常推薦使用基于熒光檢測的細胞計數儀，例如LUNA-FX7™自動細胞計數儀，以提高PBMC計數的準確性。然而，在僅使用明場光學系統的經濟型方案中，實現精準的PBMC計數仍具有一定挑戰性。為了解決這個問題，LUNA-III™自動細胞計數儀開發了一項新策略，結合焦平面偏移校正技術和優化的細胞檢測算法，以提升檢測精度。同時使用臺盼藍（Trypan Blue, TB）等染色溶液能夠增強細胞邊緣的可見度，從而進一步提高檢測準確性。
       
本應用說明將通過對比LUNA-III™自動細胞計數儀與LUNA-FX7™自動細胞計數儀在 PBMC 計數和活力測定中的表現，以驗證LUNA-III™在該應用中的有效性，并證明其作為一種可靠且經濟的解決方案的可行性。

材料和方法
人外周血經標準密度梯度離心法處理，以Histopaque-1083（Sigma，#10831）分離獲得 PBMC（外周血單核細胞）樣本。在最終洗滌后，將富含血沉棕黃層的PBMC重懸于含 1% BSA的PBS溶液中。
       
在系列稀釋測定中，PBMC以 1 至 32 倍的不同稀釋因子進行梯度稀釋。同時，另行制備了一批用于活力測定的 PBMC 樣本，并設定理論細胞活力水平分別為0%、25%、50%、75%和100%。細胞計數與活力測定采用LUNA-III™自動細胞計數儀進行，使用LUNA™細胞計數專用載片，并啟用內置PBMC計數程序（見表 1）。
       
在上樣前，細胞樣本按 1:1 體積比與0.4%臺盼藍溶液（貨號T13001）混合。此外，同一批樣本亦用于LUNA-FX7™自動細胞計數儀測試，以對比兩者的測定結果。
在 LUNA-III™ 上使用不同偏移水平評估 PBMC 濃度及活力
使用LUNA-III™和LUNA-FX7™在三個不同的偏移水平（0、1 和 2）下測試PBMC樣本，以驗證其在不同濃度和活力水平下的線性關系。
       
所有偏移水平下的細胞濃度均表現出較強的相關性，R²值均在 0.9921 以上（圖 1A）。盡管所有偏移水平均表現出良好的線性，但偏移水平 2 的測量結果最接近 LUNA-FX7™ 的數據。此外，LUNA-III™ 能夠準確識別并標記 PBMC（圖 1B）。
圖1. (A) 在不同稀釋梯度的 PBMC 樣本中，LUNA-III™ 細胞計數與理論細胞濃度之間的線性關系。
(B) 使用 LUNA-III™ BF-total 模式檢測不同稀釋水平的代表性圖像。橙色圓圈標記 LUNA-III™ 識別出的細胞，檢測到的細胞數量從左至右逐漸增加，對應的稀釋倍數范圍為 1 至 32。
BF-total：測量細胞總數的明場細胞計數模式。
 
在三個偏移水平（0、1 和 2）下進行細胞活力測定，并與LUNA-FX7™的活力數據進行對比分析。盡管偏移水平1和2與理論活力值表現出較強的相關性（R² = 0.9906 和 0.9987），但僅有偏移水平2的結果與LUNA-FX7™數據高度一致（圖 2A）。偏移水平0與理論活力值的相關性較低（R² = 0.9579），且其測量結果與LUNA-FX7™存在較大偏差。在LUNA-III™系統中，偏移水平2對不同活力水平的活細胞與死細胞標記最為準確（圖 2B）。

圖2. (A) 比較 LUNA-III™ 在三個偏移水平（0、1 和 2）下測得的細胞活力與 LUNA-FX7™ 的測量結果。
(B) LUNA-III™ 在偏移水平 0、1 和 2 下的細胞活力標記示例圖。紅色圓圈表示死亡細胞，綠色圓圈表示存活細胞。
*LUNA-FX7™ BF-Viability：LUNA-FX7™ 使用明場成像評估細胞活力的計數模式。

使用臺盼藍染色法進行外周血單核細胞（PBMC）計數的局限性
盡管我們的研究結果證明了使用LUNA-III™進行PBMC的臺盼藍染色法是有效的，但該方法在PBMC計數方面存在顯著局限性。臺盼藍染色法的一個主要問題是無法區分PBMC與污染物，如紅細胞和碎片。這可能導致總細胞計數的過高估算以及細胞活性的不準確評估，因為污染物可能被錯誤地計為死亡細胞。相比之下，熒光染色方法，如LUNA-FX7™等基于熒光的細胞計數器所使用的方法，通過選擇性地識別活細胞和死亡細胞，并有效排除污染物，提供更為準確的評估。因此，對于可能含有紅細胞或碎片的PBMC樣本，強烈建議使用熒光染色方法，以確保結果的精準性，特別是在細胞活性和總細胞計數要求高準確度時。

結論
LUNA-III™通過集成焦平面偏移和先進的細胞檢測算法，顯著提高了PBMC計數和活性評估的準確性和精確度，其中偏移級別2的表現與LUNA-FX7™的高性能非常匹配。然而需要認識到，盡管LUNA-III™提供了一種具有成本效益的解決方案，使用臺盼藍染色法仍可能面臨挑戰。臺盼藍染色法無法區分PBMC與污染物（如紅細胞和碎片），這可能導致細胞計數的過高估計和活性讀數的不準確，因為污染物可能被誤計為死亡細胞。因此，用戶在處理PBMC樣本時必須考慮這些局限性，特別是在對活性測量要求更高精度的情況下。

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