基因治療 HEK293 工程株單克隆培養(yǎng)流程優(yōu)化

人胚胎腎（HEK）細(xì)胞，尤其是經(jīng)過(guò)基因編輯的 HEK293 衍生物，是基因治療和生物制品開發(fā)常用的細(xì)胞株。目前，越來(lái)越多的應(yīng)用涉及 HEK 單克隆細(xì)胞庫(kù)的建立，但是 HEK 單細(xì)胞的生長(zhǎng)仍然是一個(gè)持續(xù)存在的瓶頸。在單細(xì)胞分選后，細(xì)胞的恢復(fù)率通常較低，且克隆形成不穩(wěn)定，這導(dǎo)致項(xiàng)目周期延長(zhǎng)、耗材及試劑用量增加。而傳統(tǒng)的補(bǔ)充劑或條件培養(yǎng)基往往存在變異性且制備過(guò)程繁瑣的問題。故優(yōu)化 HEK 單克隆培養(yǎng)體系是非常關(guān)鍵的。

NewBiologix 是一家專注于基因治療應(yīng)用的工程化 HEK293 細(xì)胞株平臺(tái)（Xcell™ Eng-HEK293）的生物技術(shù)公司，該公司致力于 HEK293 細(xì)胞株培養(yǎng)體系的優(yōu)化。本文介紹了 NewBiologix 使用 InstiGRO HEK 優(yōu)化 HEK 293 單細(xì)胞培養(yǎng)體系的經(jīng)驗(yàn)，并將其與另一種常用的補(bǔ)充劑（Suppl. Mix A）進(jìn)行了對(duì)比，實(shí)驗(yàn)表明 InstiGRO 能夠顯著促進(jìn) HEK293 單細(xì)胞活率，提高篩選效率。

材料與方法 

細(xì)胞株：NewBiologix 在所有實(shí)驗(yàn)中使用了經(jīng)過(guò)工程改造的 HEK293 細(xì)胞株，即 Xcell™ Eng-HEK293。細(xì)胞在 384 孔板中進(jìn)行鋪板，使用的是細(xì)胞分選儀 1（用于實(shí)驗(yàn) 1 和實(shí)驗(yàn) 2）和細(xì)胞分選儀 2（僅用于實(shí)驗(yàn) 2）。
培養(yǎng)基條件：兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)分別使用兩種培養(yǎng)基，即稱為培養(yǎng)基 1 和培養(yǎng)基 2。
預(yù)處理?xiàng)l件：對(duì)于實(shí)驗(yàn) 1，一組細(xì)胞在分離前用 InstiGRO HEK（1/20）培養(yǎng) 22 小時(shí)。另一組細(xì)胞則未進(jìn)行處理。
克隆恢復(fù)率定義：HEK 細(xì)胞在分離后經(jīng)過(guò) 10 天的培養(yǎng)，選取直徑≥ 150 微米的克隆團(tuán)定義為一個(gè)有效的克隆團(tuán)。克隆恢復(fù)率計(jì)算公式為：（直徑≥ 150 微米的克隆團(tuán)孔數(shù)/鋪板單個(gè)細(xì)胞的總孔數(shù)）× 100。
補(bǔ)充劑測(cè)試條件：
Suppl. Mix A
Suppl. Mix A + 20% CM
InstiGRO^® HEK (1/20 稀釋倍數(shù))
InstiGRO^® HEK (1/20 稀釋倍數(shù)) + 20% CM 

鋪板版型：
實(shí)驗(yàn) 1：使用單細(xì)胞分選儀 1 鋪 2 塊 384 孔板
實(shí)驗(yàn) 2：使用單細(xì)胞分選儀 1鋪 1 塊 384 孔板；使用使用單細(xì)胞分選儀 2 鋪 3 塊 384 孔板。

結(jié)果

在實(shí)驗(yàn) 1 中，Xcell™ Eng-HEK293 細(xì)胞在分離前 22 小時(shí)用 InstiGRO HEK 處理或不處理。隨后，分別在兩種培養(yǎng)基類型下測(cè)試了四種補(bǔ)充劑條件。如圖 1 所示，1/20 InstiGRO HEK + 20% CM 的組合在兩種培養(yǎng)基和處理?xiàng)l件下均實(shí)現(xiàn)了最高的單克隆恢復(fù)率，尤其是在使用培養(yǎng)基 2 且未預(yù)先處理的細(xì)胞中，單克隆恢復(fù)率高達(dá) 64%。

圖1. 不同補(bǔ)劑條件下的單克隆恢復(fù)率。條形圖表示在 Day10 含有直徑 ≥150 微米克隆團(tuán)的孔的百分比（每種條件 n = 48 孔）。無(wú)論是否進(jìn)行預(yù)處理，InstiGRO HEK 相比補(bǔ)劑混合物 A 都顯著提高了克隆恢復(fù)率。

相比于補(bǔ)劑 Mix A,InstiGRO HEK 顯著增加了克隆團(tuán)直徑。
為了評(píng)估克隆團(tuán)的健康狀況和穩(wěn)定性，我們?cè)趩渭?xì)胞分離后第 10 天通過(guò)成像分析測(cè)量了平均克隆直徑。如圖 2 所示，無(wú)論是否添加條件培養(yǎng)基（CM），相比于補(bǔ)劑 MixA，InstiGRO HEK 均能促進(jìn)克隆團(tuán)生長(zhǎng)，克隆團(tuán)直徑更大。無(wú)論使用哪種培養(yǎng)基，添加 1/20 InstiGRO HEK 和 20% 條件培養(yǎng)基的條件下，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)預(yù)處理，觀察到的平均克隆團(tuán)直徑最大。

圖2. 實(shí)驗(yàn) 1 中不同補(bǔ)劑條件下平均克隆團(tuán)直徑（微米）。克隆團(tuán)直徑通過(guò)成像進(jìn)行分析。圖中數(shù)據(jù)為每種條件下 48 個(gè)孔的平均值。在兩種測(cè)試培養(yǎng)基中，InstiGRO HEK 均顯著提高了克隆團(tuán)大小，與對(duì)照補(bǔ)劑相比效果尤為明顯。

不同單細(xì)胞鋪板儀使用 InstiGRO HEK 的單克隆恢復(fù)率保持一致。
在實(shí)驗(yàn) 2 中， 通過(guò)使用兩種不同的細(xì)胞分選儀來(lái)評(píng)估 InstiGRO HEK 性能的可重復(fù)性。Xcell™ Eng-HEK293 細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞分選儀 1 或細(xì)胞分選儀 2 被分離到 384 孔板中，并在含有補(bǔ)劑 Mix A + 20% 條件培養(yǎng)基（CM）與 1/20 InstiGRO HEK + 20% 條件培養(yǎng)基的條件下評(píng)估單克隆恢復(fù)率。

如圖 3 所示，InstiGRO HEK 在兩種細(xì)胞分選儀和培養(yǎng)基條件下均保持了較高的單克隆恢復(fù)率。補(bǔ)劑 mixA 的條件下單克隆恢復(fù)率最高可達(dá) 15% 到 26%，而 InstiGRO HEK 的條件下單克隆恢復(fù)率達(dá)到了 49% 到 52%，這證實(shí)了該補(bǔ)劑的穩(wěn)定性，且不受分離方法的影響。

圖3. 實(shí)驗(yàn) 2 中使用兩種不同細(xì)胞分選儀的單克隆恢復(fù)率比較。條形圖表示每種條件下含有直徑 ≥150 微米的存活但克隆團(tuán)的孔的平均百分比（每種條件 n = 128-384 孔）。在兩種細(xì)胞分選儀中，InstiGRO HEK + 條件培養(yǎng)基（CM）的表現(xiàn)均優(yōu)于補(bǔ)劑 Mix A + 條件培養(yǎng)基（CM）。

討論與結(jié)論

NewBiologix 評(píng)估了不同補(bǔ)劑對(duì) HEK293 工程株單克隆工作流程的促進(jìn)作用。在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論是否添加條件培養(yǎng)基 CM，InstiGRO HEK 均展現(xiàn)出比補(bǔ)劑 mixA 更高的單細(xì)胞恢復(fù)率和更大的平均克隆團(tuán)直徑。這些改進(jìn)在兩種不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中均有體現(xiàn)，并且在兩種測(cè)試的細(xì)胞分選儀中表現(xiàn)一致。

無(wú)需預(yù)處理且?guī)缀醪灰蕾嚄l件培養(yǎng)基即可獲得穩(wěn)定結(jié)果，表明 InstiGRO HEK 為 HEK 細(xì)胞分離后的擴(kuò)增提供了一種可重復(fù)、易適配的解決方案。這能顯著降低繁瑣工藝，尤其適用于早期開發(fā)階段——此時(shí)擴(kuò)增效率與一致性至關(guān)重要。
 

“InstiGRO HEK 幫助我們實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的高單細(xì)胞恢復(fù)率，并培養(yǎng)出體積大、狀態(tài)健康的克隆團(tuán)。我們可以快速且輕松地將 InstiGRO HEK 整合到單細(xì)胞分離工作流程中。”

——Melissa Vona

NewBiologix高級(jí)研發(fā)工程師

關(guān)于NewBiologix

NewBiologix SA 是一家專注于基因與細(xì)胞治療生產(chǎn)的瑞士生物技術(shù)公司，致力于創(chuàng)新工程化解決方案與前沿技術(shù)。公司憑借在細(xì)胞系工程領(lǐng)域的深厚專長(zhǎng)，結(jié)合對(duì)基因治療生產(chǎn)痛點(diǎn)的精準(zhǔn)洞察，推出了 Xcell™ 技術(shù)組合，一套可深度解析重組腺相關(guān)病毒（rAAV）質(zhì)量的全流程技術(shù)平臺(tái)。通過(guò)幫助合作伙伴更快、更安全、更大規(guī)模地生產(chǎn)高可靠性基因療法，NewBiologix 正在重塑患者健康的未來(lái)。
了解更多信息請(qǐng)?jiān)L問：www.newbiologix.com 

關(guān)于InstiGRO HEK

安達(dá)望（Advanced Instruments） 提供一系列化學(xué)成分明確、無(wú)動(dòng)物源成分的細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)劑，專為支持 HEK293 細(xì)胞而設(shè)計(jì)。InstiTHAW^®、InstiGRO^® 和 InstiSHAKE^® 三款細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)劑經(jīng)過(guò)精心研發(fā)，可全方位助力基因治療開發(fā)，確保細(xì)胞生長(zhǎng)與性能達(dá)到卓越水平。 

InstiTHAW HEK：在細(xì)胞凍存與復(fù)蘇過(guò)程中提供全面保護(hù)，最大限度減少損傷。InstiGRO HEK：在單細(xì)胞分離后及穩(wěn)定細(xì)胞株開發(fā)階段為細(xì)胞提供關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)健康克隆團(tuán)的形成。InstiSHAKE HEK：優(yōu)化搖瓶培養(yǎng)條件，為重組病毒載體的規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。 

特別說(shuō)明：  

InstiGRO HEK 專為單細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)，能持續(xù)支持單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)形成健壯的克隆團(tuán)。其使用極為便捷——只需將補(bǔ)劑加入培養(yǎng)基，即可直接進(jìn)行單細(xì)胞鋪板，無(wú)需額外步驟。