基因治療 HEK293 工程株單克隆培養流程優化
人胚胎腎（HEK）細胞，尤其是經過基因編輯的 HEK293 衍生物，是基因治療和生物制品開發常用的細胞株。目前，越來越多的應用涉及 HEK 單克隆細胞庫的建立，但是 HEK 單細胞的生長仍然是一個持續存在的瓶頸。在單細胞分選后，細胞的恢復率通常較低，且克隆形成不穩定，這導致項目周期延長、耗材及試劑用量增加。而傳統的補充劑或條件培養基往往存在變異性且制備過程繁瑣的問題。故優化 HEK 單克隆培養體系是非常關鍵的。
NewBiologix 是一家專注于基因治療應用的工程化 HEK293 細胞株平臺（Xcell™ Eng-HEK293）的生物技術公司，該公司致力于 HEK293 細胞株培養體系的優化。本文介紹了 NewBiologix 使用 InstiGRO HEK 優化 HEK 293 單細胞培養體系的經驗，并將其與另一種常用的補充劑（Suppl. Mix A）進行了對比，實驗表明 InstiGRO 能夠顯著促進 HEK293 單細胞活率，提高篩選效率。
材料與方法
細胞株：NewBiologix 在所有實驗中使用了經過工程改造的 HEK293 細胞株，即 Xcell™ Eng-HEK293。細胞在 384 孔板中進行鋪板，使用的是細胞分選儀 1（用于實驗 1 和實驗 2）和細胞分選儀 2（僅用于實驗 2）。
培養基條件：兩個平行實驗分別使用兩種培養基，即稱為培養基 1 和培養基 2。
預處理條件：對于實驗 1，一組細胞在分離前用 InstiGRO HEK（1/20）培養 22 小時。另一組細胞則未進行處理。
克隆恢復率定義：HEK 細胞在分離后經過 10 天的培養，選取直徑≥ 150 微米的克隆團定義為一個有效的克隆團。克隆恢復率計算公式為：（直徑≥ 150 微米的克隆團孔數/鋪板單個細胞的總孔數）× 100。
補充劑測試條件：
Suppl. Mix A
Suppl. Mix A + 20% CM
InstiGRO® HEK (1/20 稀釋倍數)
InstiGRO® HEK (1/20 稀釋倍數) + 20% CM
鋪板版型：
實驗 1：使用單細胞分選儀 1 鋪 2 塊 384 孔板
實驗 2：使用單細胞分選儀 1鋪 1 塊 384 孔板；使用使用單細胞分選儀 2 鋪 3 塊 384 孔板。
結果
在實驗 1 中，Xcell™ Eng-HEK293 細胞在分離前 22 小時用 InstiGRO HEK 處理或不處理。隨后，分別在兩種培養基類型下測試了四種補充劑條件。如圖 1 所示，1/20 InstiGRO HEK + 20% CM 的組合在兩種培養基和處理條件下均實現了最高的單克隆恢復率，尤其是在使用培養基 2 且未預先處理的細胞中，單克隆恢復率高達 64%。
圖1. 不同補劑條件下的單克隆恢復率。條形圖表示在 Day10 含有直徑 ≥150 微米克隆團的孔的百分比（每種條件 n = 48 孔）。無論是否進行預處理，InstiGRO HEK 相比補劑混合物 A 都顯著提高了克隆恢復率。
相比于補劑 Mix A,InstiGRO HEK 顯著增加了克隆團直徑。
為了評估克隆團的健康狀況和穩定性，我們在單細胞分離后第 10 天通過成像分析測量了平均克隆直徑。如圖 2 所示，無論是否添加條件培養基（CM），相比于補劑 MixA，InstiGRO HEK 均能促進克隆團生長，克隆團直徑更大。無論使用哪種培養基，添加 1/20 InstiGRO HEK 和 20% 條件培養基的條件下，無論是否經過預處理，觀察到的平均克隆團直徑最大。
圖2. 實驗 1 中不同補劑條件下平均克隆團直徑（微米）。克隆團直徑通過成像進行分析。圖中數據為每種條件下 48 個孔的平均值。在兩種測試培養基中，InstiGRO HEK 均顯著提高了克隆團大小，與對照補劑相比效果尤為明顯。
不同單細胞鋪板儀使用 InstiGRO HEK 的單克隆恢復率保持一致。
在實驗 2 中， 通過使用兩種不同的細胞分選儀來評估 InstiGRO HEK 性能的可重復性。Xcell™ Eng-HEK293 細胞通過細胞分選儀 1 或細胞分選儀 2 被分離到 384 孔板中，并在含有補劑 Mix A + 20% 條件培養基（CM）與 1/20 InstiGRO HEK + 20% 條件培養基的條件下評估單克隆恢復率。
如圖 3 所示，InstiGRO HEK 在兩種細胞分選儀和培養基條件下均保持了較高的單克隆恢復率。補劑 mixA 的條件下單克隆恢復率最高可達 15% 到 26%，而 InstiGRO HEK 的條件下單克隆恢復率達到了 49% 到 52%，這證實了該補劑的穩定性，且不受分離方法的影響。
圖3. 實驗 2 中使用兩種不同細胞分選儀的單克隆恢復率比較。條形圖表示每種條件下含有直徑 ≥150 微米的存活但克隆團的孔的平均百分比（每種條件 n = 128-384 孔）。在兩種細胞分選儀中，InstiGRO HEK + 條件培養基（CM）的表現均優于補劑 Mix A + 條件培養基（CM）。
討論與結論
NewBiologix 評估了不同補劑對 HEK293 工程株單克隆工作流程的促進作用。在兩個獨立實驗中，無論是否添加條件培養基 CM，InstiGRO HEK 均展現出比補劑 mixA 更高的單細胞恢復率和更大的平均克隆團直徑。這些改進在兩種不同的基礎培養基中均有體現，并且在兩種測試的細胞分選儀中表現一致。
無需預處理且幾乎不依賴條件培養基即可獲得穩定結果，表明 InstiGRO HEK 為 HEK 細胞分離后的擴增提供了一種可重復、易適配的解決方案。這能顯著降低繁瑣工藝，尤其適用于早期開發階段——此時擴增效率與一致性至關重要。
“InstiGRO HEK 幫助我們實現了穩定的高單細胞恢復率，并培養出體積大、狀態健康的克隆團。我們可以快速且輕松地將 InstiGRO HEK 整合到單細胞分離工作流程中。”
——Melissa Vona
NewBiologix高級研發工程師
關于NewBiologix
NewBiologix SA 是一家專注于基因與細胞治療生產的瑞士生物技術公司，致力于創新工程化解決方案與前沿技術。公司憑借在細胞系工程領域的深厚專長，結合對基因治療生產痛點的精準洞察，推出了 Xcell™ 技術組合，一套可深度解析重組腺相關病毒（rAAV）質量的全流程技術平臺。通過幫助合作伙伴更快、更安全、更大規模地生產高可靠性基因療法，NewBiologix 正在重塑患者健康的未來。
了解更多信息請訪問：www.newbiologix.com
關于InstiGRO HEK
安達望（Advanced Instruments） 提供一系列化學成分明確、無動物源成分的細胞生長補劑，專為支持 HEK293 細胞而設計。InstiTHAW®、InstiGRO® 和 InstiSHAKE® 三款細胞培養補劑經過精心研發，可全方位助力基因治療開發，確保細胞生長與性能達到卓越水平。
InstiTHAW HEK：在細胞凍存與復蘇過程中提供全面保護，最大限度減少損傷。InstiGRO HEK：在單細胞分離后及穩定細胞株開發階段為細胞提供關鍵營養，促進健康克隆團的形成。InstiSHAKE HEK：優化搖瓶培養條件，為重組病毒載體的規模化生產奠定基礎。
特別說明：
InstiGRO HEK 專為單細胞培養設計，能持續支持單個細胞生長形成健壯的克隆團。其使用極為便捷——只需將補劑加入培養基，即可直接進行單細胞鋪板，無需額外步驟。
