AAV（ 腺相關(guān)病毒）助力解鎖阿爾茨海默癥造模研究

阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是一種多發(fā)于老年人群的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，又稱(chēng)老年性癡呆，主要影響65歲及以上的群體。臨床上，AD表現(xiàn)為認(rèn)知能力下降、記憶喪失和行為改變等多種癥狀，最初表現(xiàn)為輕度認(rèn)知性癡呆，最終發(fā)展為嚴(yán)重的智力缺陷和無(wú)法應(yīng)付日常生活。AD典型的病理特征為β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成的老年斑、tau蛋白過(guò)度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFTs）以及神經(jīng)元丟失。

AD病理機(jī)制

AD發(fā)病機(jī)制涉及多因素，包括遺傳、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等，下面介紹兩種主要因素：

1）淀粉樣蛋白聚集

β 淀粉樣蛋白(amyloid-β, Aβ)是由淀粉樣前體蛋白(Aβ precursor protein, APP)經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶（其催化亞基由早老素基因PSEN1與PSEN2編碼，二者變異也會(huì)影響Aβ生成）水解而形成的39~43個(gè)氨基酸殘基的Aβ片段。它由多種細(xì)胞產(chǎn)生，在血液和腦脊液中循環(huán)，且單體Aβ 在大腦中有保護(hù)神經(jīng)元的作用。有研究表明，細(xì)胞產(chǎn)生的Aβ 類(lèi)型主要是Aβ40，其次為Aβ42。在生理情況下，Aβ 蛋白可以被胰島素酶和腦啡肽酶降解，不會(huì)產(chǎn)生沉積。當(dāng)機(jī)體Aβ 生成和清除機(jī)制失衡時(shí)，Aβ 蛋白就會(huì)發(fā)生聚集，沉積于大腦中就會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性，從而導(dǎo)致記憶損傷和神經(jīng)元細(xì)胞死亡。研究表明，Aβ42與Aβ40相比，由于多出兩個(gè)疏水性的氨基酸，它更容易形成聚集體，因此具有更高的神經(jīng)毒性。

2）Tau蛋白磷酸化

微管相關(guān)蛋白Tau由MAPT基因編碼，在神經(jīng)元軸突中高度表達(dá)，參與軸突的微管組裝和功能，對(duì)于保持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有至關(guān)重要的作用。目前科學(xué)界普遍認(rèn)為，Tau蛋白的異常高磷酸化以及其聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，是與阿爾茨海默病進(jìn)展密切相關(guān)的關(guān)鍵因素。Tau蛋白磷酸化水平的增加主要是由于多種激酶的活性增強(qiáng)，包括酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸激酶(Tyr/Ser/Thr)、糖原合成酶激酶-3β (GSK-3β)以及細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶5 (CDK5)等。研究顯示，在阿爾茨海默病患者的大腦中，磷酸化的Tau蛋白含量顯著增加，并且患者的認(rèn)知功能障礙程度與神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)的密集程度呈現(xiàn)出正相關(guān)性。

阿爾茨海默癥的發(fā)病機(jī)制

AD常用造模方法及原理

AD動(dòng)物模型的構(gòu)建和研究為理解AD復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。AD造模的核心思路是以病理特征（Aβ沉積、tau病變、神經(jīng)元丟失）、生理異常（神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、代謝障礙）和臨床表現(xiàn)（認(rèn)知衰退、突觸損傷）為導(dǎo)向，通過(guò)多因素疊加（如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物聯(lián)合環(huán)境壓力、藥物誘導(dǎo)復(fù)合病理）、動(dòng)態(tài)評(píng)估（縱向行為學(xué)與病理檢測(cè)）以及新興技術(shù)（類(lèi)器官模型、基因編輯）構(gòu)建更接近人類(lèi)AD的動(dòng)物或體外模型，同時(shí)結(jié)合臨床生物標(biāo)志物驗(yàn)證（Aβ42、pTau等），最終實(shí)現(xiàn)從分子機(jī)制到行為表型的全面模擬，為病理機(jī)制解析和藥物研發(fā)提供高仿真研究平臺(tái)。

AD造模方法匯總

AAV介導(dǎo)的AD造模方法

AAV是一種單鏈DNA病毒，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，其優(yōu)勢(shì)在于安全性高，免疫原性低，能夠在不引發(fā)宿主強(qiáng)烈免疫反應(yīng)的情況下，將特定基因高效遞送至目標(biāo)細(xì)胞，已成為基因治療和疾病模型構(gòu)建中的理想工具。

利用AAV進(jìn)行阿爾茨海默病疾病造模具有多方面優(yōu)勢(shì)

1. 靶向精準(zhǔn)：可通過(guò)選擇血清型或啟動(dòng)子，靶向特定神經(jīng)細(xì)胞。

2. 免疫原性低：引發(fā)免疫反應(yīng)弱，維持模型穩(wěn)定和可重復(fù)，準(zhǔn)確反映疾病進(jìn)程。

3. 多基因搭載：載體可同時(shí)攜帶多個(gè)目的基因，模擬AD復(fù)雜病理過(guò)程。

4. 操作簡(jiǎn)便：相比轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型構(gòu)建，AAV制備和使用更簡(jiǎn)單，遞送途徑多樣，節(jié)省時(shí)間成本，提升實(shí)驗(yàn)效率。

5. 表達(dá)可控：選擇不同啟動(dòng)子可精確調(diào)控基因表達(dá)水平，研究基因表達(dá)量與疾病癥狀的關(guān)系，深入探索發(fā)病機(jī)制。

在AD造模中，通過(guò)不同的給藥途徑，利用AAV將淀粉樣前體蛋白基因、Tau蛋白基因或其突變體等導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，可模擬AD的病理特征，幫助科學(xué)家深入探究AD的發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)有效的治療方法。

AAV-Aβ造模參考案例

文章題目：Intra-and extracellular β-amyloid overexpression via adenoassociated virus-mediated gene transfer impairs memory and synaptic plasticity in the hippocampus

編碼BRI-Aβ cDNA（人Aβ肽和BRI蛋白的融合物）的AAV載體，能夠在沒(méi)有APP過(guò)表達(dá)的情況下促進(jìn)Aβ肽的高水平表達(dá)。研究人員分別構(gòu)建AAV-BRI-Aβ42、AAV-UBI-Aβ42和AAV-EGFP，并通過(guò)雙側(cè)海馬區(qū)注射入小鼠體內(nèi)。與UBI-Aβ42構(gòu)建體相比，BRI-Aβ42構(gòu)建體的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致可溶性和不溶性Aβ42的表達(dá)更高，而EGFP孵育后沒(méi)有檢測(cè)到Aβ；對(duì)BRI-Aβ42構(gòu)建體進(jìn)行6E10免疫染色，結(jié)果顯示海馬體中有大量淀粉樣蛋白沉積，而接受UBI-Aβ42處理的小鼠表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)元突起染色，神經(jīng)元內(nèi)有輕微的Aβ積聚，但沒(méi)有Aβ沉積物的積聚。Morris Water迷宮測(cè)試發(fā)現(xiàn)用兩種Aβ AAV構(gòu)建體處理的動(dòng)物表現(xiàn)出顯著的認(rèn)知障礙。

注射AAV-BRI-Aβ42和AAV-UBI-Aβ42后小鼠海馬中Aβ的表達(dá)

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