DAP-seq和RNA-seq聯合助力揭示大豆異黃酮生物合成調控新機制
2025年10月25日，南京農業大學國家大豆改良中心喻德躍教授團隊在Plant Biotechnology Journal（IF: 10.5）上在線發表了題為GmMYB4 Positively Regulates Isoflavone Biosynthesis via the GmMAPK6-GmMYB4-MBW Module in Soybean的研究論文，通過DAP-seq和RNA-seq聯合分析，從多維度系統解析了轉錄因子GmMYB4調控大豆異黃酮生物合成的分子機制，首次揭示GmMAPK6-GmMYB4-MBW調控模塊在異黃酮代謝網絡中的核心作用，為高異黃酮含量大豆品種培育提供關鍵理論依據與基因資源。藍景科信為該研究提供了DAP-seq和RNA-seq技術支持。
大豆是重要的糧飼兼用和油料作物，富含異黃酮、葉酸、維生素E、皂苷等多種生物活性物質。其中異黃酮作為豆科植物特有的生物活性成分，兼具抗氧化、抗炎及內分泌調節等功能，對優化大豆營養品質至關重要。其含量精準調控一直是大豆育種領域的核心目標。
大豆異黃酮是豆科植物特有的次生代謝產物，其合成依賴苯丙烷途徑的分支路徑，與花青素合成共享前體物質（如柚皮素），形成 “代謝競爭關系”。此前研究已發現MYB轉錄因子家族是異黃酮合成的關鍵調控因子，但這類因子如何通過復雜的分子網絡精準調控異黃酮含量，尤其是與其他信號通路（如MAPK信號）的協同機制，仍存在大量未知。
主要研究結果
核心發現一：GmMYB4——異黃酮合成的“正向調控開關”
大豆異黃酮是豆科植物特有的次生代謝產物，其合成依賴苯丙烷途徑的分支路徑，與花青素合成共享前體物質（如柚皮素），形成 “代謝競爭關系”。此前研究已發現MYB轉錄因子家族是異黃酮合成的關鍵調控因子，但這類因子如何通過復雜的分子網絡精準調控異黃酮含量，尤其是與其他信號通路（如MAPK信號）的協同機制，仍存在大量未知。
主要研究結果
核心發現一：GmMYB4——異黃酮合成的“正向調控開關”
- GWAS定位候選基因GmMYB4
為挖掘調控大豆異黃酮含量的關鍵基因，本研究收集了219份大豆種質資源在三種不同環境環境下的總異黃酮含量（TIC）、染料木黃酮類含量（GEC）、大豆苷元類含量（DAC）及黃豆黃素類含量（GLC）數據，并開展全基因組關聯分析（GWAS），在11號染色體8.15-8.27 Mb區間鎖定231個顯著SNP，并最終篩選出GmMYB4（Glyma.11g107100）作為核心候選基因——該基因屬于R2R3-MYB家族，與擬南芥中調控類黃酮合成的MYB4同源。通過單倍型分析發現：攜帶GmMYB4H1單倍型的大豆材料，其GLC含量在三年環境中均顯著高于H2單倍型材料，證明GmMYB4H1是調控異黃酮的“優異單倍型”。
- GmMYB4基因功能驗證
為確認GmMYB4的功能，通過構建大豆毛狀根過表達與RNAi干涉體系，以及穩定轉基因過表達株系和CRISPR/Cas9敲除突變體，結合RT-qPCR與代謝物（TIC、GEC、DAC、GLC）含量測定，結果顯示過表達株系異黃酮總含量及各組分含量顯著提升，敲除突變體株系顯著下降，證實GmMYB4為大豆異黃酮生物合成的正向調控因子。
值得注意的是，大豆基因組中存在GmMYB4的同源基因Glyma.12g032200，雙基因敲除后GLC含量驟降97%，遠高于單敲除效果，證明同源基因存在“功能補償效應”。
值得注意的是，大豆基因組中存在GmMYB4的同源基因Glyma.12g032200，雙基因敲除后GLC含量驟降97%，遠高于單敲除效果，證明同源基因存在“功能補償效應”。
圖1 大豆中GLC相關基因位點的鑒定與分析。
圖2 GmMYB4單倍型分析及初步功能驗證。
核心發現二：GmMYB4 通過“干擾MBW復合體”平衡異黃酮與花青素合成
- GmMYB4調控分子機制探究
研究團隊對GmMYB4過表達株系、敲除突變體及WT材料進行轉錄組測序（RNA-seq），發現GmMYB4在調控代謝途徑中發揮關鍵作用，尤其對類黃酮和異黃酮的生物合成途徑調控作用顯著。RT-qPCR結果顯示，異黃酮生物合成途徑中的7個關鍵基因（GmPAL1.3、GmC4H、GmCHS8、GmCHR1、GmCHI1、GmIFS2 和GmIFS1）在GmMYB4過表達株系中顯著上調，在gmmyb4突變體中則顯著下調。
此外，過表達GmIFS2導致R2期（盛花期）葉片和R8期（完熟期）種子中總異黃酮（TIC）含量顯著增加，與異黃酮生物合成存在競爭關系的基因GmANS3呈現出完全相反的表達趨勢。這些結果表明表明GmMYB4不僅能調控異黃酮生物合成途徑相關基因的表達量及異黃酮含量，同時還能抑制花青素代謝途徑。
通過DAP-seq鑒定到GmMYB4的核心結合基序為5′-CACCTAAC-3′，同時進行了EMSA驗證了GmMYB4與motif序列的結合。DAP-seq和RNA-seq聯合分析最終鑒定出1477個潛在靶基因，并富集于類黃酮生物合成通路。GmMYB4過表達株系種子類黃酮與原花青素含量較WT顯著提升，敲除突變體則呈現相反趨勢。結果表明GmMYB4是調控大豆類黃酮和原花青素生物合成及積累的關鍵轉錄調控因子。
此外，過表達GmIFS2導致R2期（盛花期）葉片和R8期（完熟期）種子中總異黃酮（TIC）含量顯著增加，與異黃酮生物合成存在競爭關系的基因GmANS3呈現出完全相反的表達趨勢。這些結果表明表明GmMYB4不僅能調控異黃酮生物合成途徑相關基因的表達量及異黃酮含量，同時還能抑制花青素代謝途徑。
通過DAP-seq鑒定到GmMYB4的核心結合基序為5′-CACCTAAC-3′，同時進行了EMSA驗證了GmMYB4與motif序列的結合。DAP-seq和RNA-seq聯合分析最終鑒定出1477個潛在靶基因，并富集于類黃酮生物合成通路。GmMYB4過表達株系種子類黃酮與原花青素含量較WT顯著提升，敲除突變體則呈現相反趨勢。結果表明GmMYB4是調控大豆類黃酮和原花青素生物合成及積累的關鍵轉錄調控因子。
圖3 GmMYB4調控大豆異黃酮含量及苯丙烷代謝途徑相關基因的表達水平。
圖4 通過DAP-seq與RNA-seq在全基因組中對GmMYB4結合位點及靶基因進行分析。
上述結果表明，GmMYB4是調控異黃酮含量的重要基因。為闡明GmMYB4調控異黃酮生物合成的分子機制，研究人員隨后克隆了異黃酮代謝途徑中10個關鍵差異表達基因（DEGs）的啟動子，以探究GmMYB4是否能直接靶向這些基因。酵母單雜交（Y1H）實驗結果顯示，GmMYB4無法結合這10個基因的啟動子。這提示GmMYB4可能通過其他調控因子，以間接調控的方式作用于異黃酮代謝途徑。
- GmMYB4競爭結合GmTT8
MBW復合體由MYB、bHLH、WD40三類蛋白組成，此前在蒺藜苜蓿種發現其可抑制異黃酮合成酶（IFS）基因表達。研究人員通過酵母單雜交（Y1H）實驗檢測了GmMYB115-GmTT8 復合體與10個關鍵基因（GmANS3、GmOMT5、Gm4CL、GmIFS2、GmANR2、GmF3H1、GmUGT、GmPAL1.3、GmC4H、GmCHS8）啟動子的結合能力。結果表明，GmMYB115-GmTT8復合體可直接結合苯丙烷、異黃酮及花青素生物合成相關基因的啟動子，凸顯了其在這些代謝途徑中的調控作用。研究團隊聚焦GmMYB4與MYB-bHLH-WD復合體（MBW）的互作機制，通過LCI、BiFC、Y2H、雙熒光素酶報告實驗顯示GmMYB4與大豆中bHLH類轉錄因子（GmTT8、GmGL3、GmEGL3）互作，競爭性干擾GmMYB115–GmTT8復合體的形成，進而解除MBW對異黃酮合成關鍵基因GmIFS2的抑制并減弱對花青素合成基因GmANS3的激活，實現異黃酮與花青素代謝流的平衡調控。
圖5 GmMYB4通過與bHLH類轉錄因子互作，干擾MBW復合體的組裝。
核心發現三：GmMAPK6通過磷酸化GmMYB4，激活異黃酮合成通路
為解析GmMYB4的上游調控機制，作者進行Co-IP、BiFC、Y2H、體外磷酸化實驗及LC-MS/MS分析，結果表明GmMAPK6可與GmMYB4直接互作，并在體外磷酸化GmMYB4的第39位絲氨酸（S39）；過表達GmMAPK6顯著提升GmMYB4及其下游異黃酮合成基因的表達，促進異黃酮積累。表明GmMAPK6通過“磷酸化修飾+轉錄激活”雙重機制調控異黃酮合成。
為解析GmMYB4的上游調控機制，作者進行Co-IP、BiFC、Y2H、體外磷酸化實驗及LC-MS/MS分析，結果表明GmMAPK6可與GmMYB4直接互作，并在體外磷酸化GmMYB4的第39位絲氨酸（S39）；過表達GmMAPK6顯著提升GmMYB4及其下游異黃酮合成基因的表達，促進異黃酮積累。表明GmMAPK6通過“磷酸化修飾+轉錄激活”雙重機制調控異黃酮合成。
圖6 GmMAPK6可提高大豆異黃酮含量，上調GmMYB4基因及異黃酮生物合成相關基因的表達水平，并能磷酸化GmMYB4蛋白。
小結
本研究系統揭示了GmMAPK6-GmMYB4-MBW模塊調控大豆異黃酮生物合成的分子機制：GmMAPK6通過磷酸化激活GmMYB4，GmMYB4進而競爭結合MBW復合體中的bHLH成員，解除MBW對異黃酮合成基因的抑制并抑制花青素合成基因，最終實現異黃酮含量的精準調控。為解析異黃酮代謝調控網絡提供了新視角，并為大豆品質改良與代謝工程育種提供了重要靶點與理論依據。
本研究系統揭示了GmMAPK6-GmMYB4-MBW模塊調控大豆異黃酮生物合成的分子機制：GmMAPK6通過磷酸化激活GmMYB4，GmMYB4進而競爭結合MBW復合體中的bHLH成員，解除MBW對異黃酮合成基因的抑制并抑制花青素合成基因，最終實現異黃酮含量的精準調控。為解析異黃酮代謝調控網絡提供了新視角，并為大豆品質改良與代謝工程育種提供了重要靶點與理論依據。
圖7 GmMAPK6-GmMYB4-MBW模塊在調控大豆異黃酮含量中作用的預測模型示意圖。
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